吡咯喹啉醌對(duì)長(zhǎng)波紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞急性光損傷的作用*

谷麗，施智男，周 舒，趙靜婷，翟小玉，顧麗群，花卉*

(南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院皮膚性病科，南通 226006)

皮膚是抵御人體外部環(huán)境的物理、化學(xué)或生物等各種刺激的第一道防線(xiàn)。皮膚過(guò)度暴露于紫外線(xiàn)(ultraviolet,UV)會(huì)導(dǎo)致各種皮膚疾病，如曬傷、紅斑、過(guò)早老化、炎癥和氧化損傷[1-2]。人類(lèi)紫外線(xiàn)暴露的主要來(lái)源是太陽(yáng)光，根據(jù)其波長(zhǎng)可分為UVC(100～290 nm)、UVB(290～320 nm)和UVA(320～400 nm)[3]。到達(dá)地球表面的紫外線(xiàn)是由95%的UVA 和5%的UVB 組成，UVA 具有更強(qiáng)的穿透性，可達(dá)皮下組織，影響真皮和表皮的皮膚結(jié)構(gòu)[4]。皮膚過(guò)度暴露UVA輻射后，會(huì)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，造成細(xì)胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和膜以及細(xì)胞器的損傷，引發(fā)多種細(xì)胞反應(yīng)，包括凋亡和炎癥[5-6]?，F(xiàn)階段人們對(duì)生活品質(zhì)的追求越來(lái)越高，因此探尋一種安全、有效的新型光防護(hù)劑，已成為皮膚科研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinine,PQQ)是一種不依賴(lài)于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和黃素腺嘌呤二核苷酸的葡萄糖脫氫酶輔基，具有極強(qiáng)抗氧化還原功效，現(xiàn)已被認(rèn)為是一種重要的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[7]。研究[8]表明PQQ 具有多種生理功能，包括保護(hù)神經(jīng)和心血管，促進(jìn)生長(zhǎng)和增殖，并作為一種抗氧化劑保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激引起的損傷。然而，關(guān)于PQQ 對(duì)UVA引起的皮膚急性光損傷的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以HaCaT 細(xì)胞為研究對(duì)象，探討PQQ 對(duì)UVA 誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞急性光損傷的保護(hù)作用及潛在機(jī)制，為新型抗皮膚光損傷產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 HaCaT 細(xì)胞購(gòu)于上海中喬新舟生物科技有限公司；PQQ 購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司；DMEM 培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)、Annexin-V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA 緩沖液、BCA 試劑盒、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)于上海碧云天生物公司；B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、β-actin 抗體購(gòu)于上海碧云天生物公司，Bcl-2-associated X 的蛋白質(zhì)(Bcl-2-associated X,Bax)抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；UVA 輻射燈、紫外線(xiàn)輻射強(qiáng)度儀購(gòu)于上海希格瑪高技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇HaCaT 細(xì)胞，接種于含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合狀態(tài)，采用0.25%胰酶消化，按1∶3 傳代至培養(yǎng)皿中。

1.2.2 CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞增殖活性 將細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%，每孔加入不同濃度(50、100、150、200、250 nmol/mL)的PQQ，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8 溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育24 h，在450 nm 吸光度下用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度(optical density,OD)值。

1.2.3 UVA 輻射 待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%后，從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)替換細(xì)胞培養(yǎng)基，用UVA 輻射強(qiáng)度儀標(biāo)定UVA 照射儀的照射度，UVA 劑量=UVA照射度×?xí)r間(s)，光照劑量為UVA 10 J/cm2，培養(yǎng)皿距燈管距離10 cm，一次性連續(xù)照射，照射結(jié)束后，各組細(xì)胞換新鮮培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 將HaCaT 細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，分為4 組：對(duì)照組、PQQ 組、UVA 組、UVA+PQQ組。對(duì)照組為正常生長(zhǎng)的HaCaT 細(xì)胞，未予其他處理；PQQ 組用150 nmol/mL PQQ 培養(yǎng)24 h；UVA 組細(xì)胞予UVA 10 J/cm2照光；UVA+PQQ 組先予PQQ預(yù)處理后培養(yǎng)24 h，然后使用10 J/cm2劑量的UVA照射。

1.2.5 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 將細(xì)胞接種于6孔板里，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%，按要求分別處理各組細(xì)胞，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)ROS 的測(cè)定 各組細(xì)胞予UVA 輻射后，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，使用無(wú)血清培養(yǎng)液1∶1 000 稀釋2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽 (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)，每孔加入1 mL 蓋住細(xì)胞。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。

1.2.7 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 各組細(xì)胞予UVA 輻射后，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用PBS 沖洗2 次，使用胰酶消化，將細(xì)胞懸液放入離心機(jī)中1 500 r/min 離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL 碘化丙啶染色液，輕輕混勻，轉(zhuǎn)入流式管中，室溫(20～25 ℃)避光孵育10～20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 Western Blot 檢測(cè) 各組細(xì)胞予UVA 輻射后，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用PBS 沖洗2 次，使用RIPA 裂解緩沖液裂解細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒(Beyotime)檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，室溫下，用5%脫脂牛奶在PBS 中封閉膜1 h，加Bcl-2、Bax 一抗(均1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜2 次，30 min/次，加二抗(1∶1 000)，室溫下孵育3 h 后用TBST 洗膜，最后采用Tanon 5200 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶表達(dá)情況。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。使用GraphPad Prism(GraphPad Software,SanDiego,CA)軟件進(jìn)行分析，檢測(cè)數(shù)據(jù)均以表示，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PQQ 對(duì)HaCaT 細(xì)胞增殖率的影響CCK-8 結(jié)果顯示，50、100、150 nmol/mL PQQ 對(duì)Ha-CaT 細(xì)胞的增殖活性無(wú)明顯影響(均P＞0.05)，濃度為200、250 nmol/mL 時(shí)，PQQ 可顯著抑制HaCaT 細(xì)胞的增殖活性(均P＜0.01)(圖1)。因此，選擇150 nmol/mL PQQ 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度PQQ 對(duì)HaCaT 細(xì)胞增殖活性的影響

2.2 PQQ 對(duì)UVA 照射HaCaT 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響正常的HaCaT 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，密集分布；UVA照射后，HaCaT 細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、體積變小，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞碎片增多，死亡細(xì)胞增加；PQQ 預(yù)處理后再予UVA 照射，細(xì)胞密度增加，細(xì)胞間隙減小，且細(xì)胞形態(tài)改善；PQQ 處理后對(duì)正常HaCaT 細(xì)胞的形態(tài)無(wú)影響(圖2)。

圖2 PQQ 對(duì)UVA 照射HaCaT 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(200×)

2.3 PQQ 對(duì)UVA 照射HaCaT 細(xì)胞ROS 水平的影響 與對(duì)照組相比，UVA 組的ROS 水平明顯升高(P＜0.05)，PQQ 組ROS 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與UVA 組相比，UVA+PQQ 組的ROS 水平明顯下降(P＜0.05)；結(jié)果表明PQQ 可以顯著降低UVA誘導(dǎo)的ROS 生成(圖3)。

圖3 PQQ 對(duì)UVA 照射HaCaT 細(xì)胞ROS 水平的影響

2.4 PQQ 對(duì)UVA 照射HaCaT 細(xì)胞凋亡率的影響與對(duì)照組相比，UVA 組細(xì)胞的凋亡率明顯增加(P＜0.05)，PQQ 組凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與UVA 組相比，UVA+PQQ 組細(xì)胞凋亡率明顯下降(P＜0.05)(圖4)。

圖4 PQQ 對(duì)UVA 照射HaCaT 細(xì)胞凋亡率的影響

2.5 PQQ 對(duì)UVA 照射后HaCaT 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 與對(duì)照組相比，UVA 組Bcl-2 的表達(dá)顯著降低，Bax 表達(dá)顯著增加(P＜0.05)；與UVA 組比較，UVA+PQQ 組Bcl-2 的表達(dá)顯著增加，Bax 的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)(圖5)。

圖5 PQQ 對(duì)UVA 輻射后HaCaT 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

3 討論

大量研究[9]證實(shí)UVA 輻射誘導(dǎo)的ROS 在皮膚細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，并導(dǎo)致皮膚氧化應(yīng)激損傷。因此，通過(guò)補(bǔ)充抗氧化劑來(lái)提高皮膚細(xì)胞的抗氧化能力，可能是預(yù)防UVA 導(dǎo)致皮膚光損傷的一個(gè)有價(jià)值的策略。PQQ 被定義為一種新型的維生素B，廣泛存在于各種食物(蔬菜、水果、牛奶等)中，已被證實(shí)具有抗氧化作用[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，PQQ 對(duì)高糖誘導(dǎo)的體外糖尿病腎病模型氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用與抑制ROS 的產(chǎn)生和提高抗氧化劑超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶的水平有關(guān)。PQQ可通過(guò)減輕軟骨細(xì)胞的氧化損傷、DNA 損傷和細(xì)胞衰老改善骨關(guān)節(jié)炎的癥狀[12]。本研究發(fā)現(xiàn)在體外建立的UVA 誘導(dǎo)的光損傷模型中，PQQ 可以保護(hù)Ha-CaT 細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，主要表現(xiàn)為明顯降低細(xì)胞ROS 含量，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，增加抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)及降低促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)。

UVA 照射可以造成被輻射細(xì)胞發(fā)生不同程度的光損傷[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，UVA 照射可引起HaCaT 細(xì)胞受損，出現(xiàn)皺縮、變圓，細(xì)胞活力降低。通過(guò)PQQ預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)PQQ 可明顯改善細(xì)胞形態(tài)，提高細(xì)胞活力，表明PQQ 可以保護(hù)細(xì)胞免受光損傷。UVA照射引起的ROS 過(guò)度釋放會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，并導(dǎo)致皮膚癌、皺紋和光老化，因此控制ROS的水平是防御UVA 光損傷的重要環(huán)節(jié)[14]。研究[15]證明黃芪多糖處理后HaCaT 細(xì)胞活力顯著增加，ROS產(chǎn)生受到抑制，同時(shí)改善線(xiàn)粒體功能障礙，對(duì)UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞光損傷具有保護(hù)作用。本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平發(fā)現(xiàn)，10 J/cm2UVA 輻射可導(dǎo)致HaCaT 細(xì)胞產(chǎn)生ROS 增多，而加入PQQ預(yù)處理可明顯抑制ROS 產(chǎn)生。這些結(jié)果提示，PQQ通過(guò)清除UVA 照射產(chǎn)生的過(guò)量ROS，提高了細(xì)胞活力，從而保護(hù)HaCaT 細(xì)胞免受UVA 誘導(dǎo)的光損傷。

ROS 的穩(wěn)態(tài)是維持細(xì)胞正常生理的一個(gè)主要因素，ROS 的失衡可能促進(jìn)線(xiàn)粒體功能障礙并觸發(fā)線(xiàn)粒體介導(dǎo)的凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡[16]。本研究結(jié)果顯示，暴露于10 J/cm2UVA 后，HaCaT 細(xì)胞的凋亡程度顯著增加，而PQQ 處理顯著減少了細(xì)胞凋亡，證明PQQ 預(yù)處理可改善細(xì)胞凋亡情況，具有抗凋亡的作用。UVA 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及外在途徑和內(nèi)在途徑，內(nèi)在途徑主要是受Bcl-2 家族蛋白和p53 腫瘤抑制蛋白調(diào)控[14]。UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要是通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)，而UVB 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與p53 的積累有關(guān)[17]。S.WU等[18]發(fā)現(xiàn)矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷預(yù)處理能增加抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax 的比值，從而降低UVA 輻射引起的成纖維細(xì)胞的凋亡。與本研究PQQ 預(yù)處理可通過(guò)上調(diào)Bcl-2 表達(dá)，并下調(diào)Bax的表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到抑制UVA 輻射導(dǎo)致的凋亡率增加的結(jié)果一致。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了PQQ 可通過(guò)降低ROS 水平，減少細(xì)胞凋亡率；同時(shí)通過(guò)上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax 的表達(dá)起到抗凋亡作用，進(jìn)而保護(hù)HaCaT細(xì)胞免于UVA 導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，為治療皮膚光損傷奠定了基礎(chǔ)，但其具體作用機(jī)制和靶點(diǎn)有待進(jìn)一步深入研究。