小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)IL-10 改善帕金森病模型小鼠運(yùn)動障礙*

彭建亞，沈康麗，陳 澍，陳 銳，袁王睿，鄧喬軒，莊乾興*

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，南通 226001)

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種常見的、由于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元退行性病變所引起的中老年性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床上主要表現(xiàn)為運(yùn)動發(fā)起困難、運(yùn)動遲緩、靜止性震顫和肌肉僵直等運(yùn)動障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至直接威脅患者的生命安全[1-2]。PD 病理進(jìn)程中伴隨著以神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活及炎癥因子的釋放為主要特征的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[3-4]。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活可釋放多種可溶性因子，包括細(xì)胞因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、自由基、脂質(zhì)代謝產(chǎn)物等。其中神經(jīng)營養(yǎng)因子如胰島素樣生長因子-1、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等能促進(jìn)受損神經(jīng)元的功能恢復(fù)而幫助受損神經(jīng)元存活，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)及保護(hù)作用。然而隨著炎癥反應(yīng)的過度激活，也會產(chǎn)生包括白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-8、IL-12、IL-18、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在內(nèi)的大量的炎性細(xì)胞因子，這些炎性細(xì)胞因子具有神經(jīng)毒性，能導(dǎo)致正常神經(jīng)元功能改變乃至凋亡[5-6]。因此，以抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)的過度激活為目的，尋找抑制炎癥介質(zhì)的釋放而促進(jìn)受損神經(jīng)元功能恢復(fù)的抑炎因子有望為PD 治療提供新的思路。

IL-10 是一種多效細(xì)胞因子，由活化的免疫細(xì)胞包括T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著多重作用，通過抑制炎癥介質(zhì)的釋放、增強(qiáng)抗炎介質(zhì)的產(chǎn)生以及抑制抗原遞呈，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能和對抗炎癥反應(yīng)，尤其是阻斷Toll 樣受體介導(dǎo)的炎癥過程[7]。在PD發(fā)生發(fā)展過程中，腦膜中的免疫細(xì)胞遷移至大腦實(shí)質(zhì)中去，這些免疫細(xì)胞被激活后通過多種機(jī)制相互作用，分泌炎性因子放大炎癥信號，同時產(chǎn)生神經(jīng)毒素直接作用于多巴胺能神經(jīng)元，最后導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。由此有效地抑制神經(jīng)炎癥也將可能成為防治PD的重要策略[8-9]。本研究利用黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta,SNc)小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)IL-10的PD 模型小鼠，探索小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)IL-10 通過影響PD 模型小鼠神經(jīng)退變和神經(jīng)炎癥在PD 運(yùn)動障礙中的作用，為PD 的發(fā)病機(jī)制和防治措施提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級8～12 周齡C57BL/6 雄性小鼠，體質(zhì)量20～30 g，購自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心倫理委員會批準(zhǔn)(S20210120-907)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腦立體定位手術(shù)及病毒注射 在異氟烷麻醉下(4%誘導(dǎo)，1.5%維持)，將小鼠置于腦立體定位儀上(1404,David Kopf Instruments,Tujunga,CA)，根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜(Paxinos and Waston,2011)，按SNc 坐標(biāo)位置(前囟后3.16 mm，中線兩側(cè)±1.25 mm，硬膜下4.1 mm)在恒流輸液泵(KDS100,KD scientific,MA)的驅(qū)動下使用微量注射器(Hamilton 7632-01,Reno,NV)將AAV9-Iba1p-IL-10-2A-EGFP(病毒滴度為5×1012，廣州派真生物技術(shù)有限公司)注入雙側(cè)SNc(每側(cè)0.5 μL，雙側(cè)共1 μL)，注射速度為20 nL/min，注畢留針20 min 以讓注射部位更好地吸收病毒，然后再以0.5 mm/min 速度將注射針緩緩拔出，防止病毒沿注射管回流而擴(kuò)散。手術(shù)后，動物被單獨(dú)飼養(yǎng)，并至少恢復(fù)72 h。

1.2.2 PD 模型小鼠的制備 (1)將小鼠隨機(jī)分為4組：正常組、PD 模型組、PD 模型+對照病毒組、PD 模型+IL-10 過表達(dá)組。(2)PD 模型組小鼠，病毒注射后第21 天腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrapyridine,MPTP)(20 mg/kg)，每隔2 h 注射1 次，共注射4 次。

1.2.3 免疫熒光組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)先前報(bào)道[10-11]的方法進(jìn)行。成年小鼠(體質(zhì)量20～30 g)經(jīng)異氟烷麻醉(4%誘導(dǎo))后，經(jīng)左心室灌流生理鹽水50 mL，然后換成含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(phosphate buffer,PB)固定液灌流250～300 mL。灌流后將腦取出，分離含SNc 的腦組織，放入4 ℃固定液中固定12 h，之后依次放入20%、30%的蔗糖溶液中脫水24 h。將脫水腦組織用O.C.T.包埋，放置冰凍切片機(jī)(CM1850,Leica,Germany)內(nèi)速冷后制作冰凍切片，切片厚度30 μm。將組織切片用含0.25% Triton X-100 的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline with Triton X-100,PBST)沖洗6 次，5 min/次，然后用含10%牛血清的PBST 室溫下封閉30 min。分別加入一抗：兔抗小鼠酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH,1∶500,MilliporeSigma,St.Louis,MO;Cat#AB152,RRID:AB_390204)和兔抗小鼠Iba1(1∶500,Wako Pure Chemical Industries,Tokyo,Japan;Cat#019-19741,RRID:AB_839504)，4 ℃過夜。PBST 沖洗6 次，5 min/次，常溫、避光下在含0.1% Triton X-100 的0.01 mol/L PBST中加入Alexa 488 連接的第二抗體(山羊抗兔，1∶2 000，Thermo Fisher Scientific,Sunnyvale,CA)孵育2 h，用含0.1% Triton X-100 的0.01 mol/L PBST 洗3 次，用封片劑(Southern Biotech,Cambridge,UK)封固。在倒置激光共聚焦顯微鏡(SP2 TCS,Leica)下觀察腦片并拍照。

1.2.4 挑戰(zhàn)平衡木測試 采用自制的挑戰(zhàn)平衡木裝置進(jìn)行動物行為學(xué)測試。該平衡木由1 根長125 cm的橫梁跑道構(gòu)成，橫梁跑道的寬度依次為3、2.5、2、1.5、1 cm，長度均為25 cm，橫梁間隔均為1 cm，高度均為4 cm，跑道最窄一端設(shè)有1 個黑色塑料鼠巢(15 cm×15 cm×8 cm)用于激發(fā)動物穿越平衡木，見圖1。平衡木離墻面50 cm，距地面90 cm，地面上鋪以軟墊以防止跌落的動物受傷。記錄動物通過平衡木的總步數(shù)、平均每步的錯誤數(shù)及通過平衡木所花費(fèi)的時間，數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖1 挑戰(zhàn)平衡木檢測裝置

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 軟件(SPSS,Chicago,IL)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以表示。分別采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及紐曼-科伊爾斯后檢驗(yàn)(Newman-Keuls post hoc test)分析不同測試組間的差異，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-10 在SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá) 依據(jù)實(shí)驗(yàn)流程(圖2A，見封二)，在SNc 微量注射IL-10 過表達(dá)腺相關(guān)病毒AAV9-Iba1p-IL-10-2A-EGFP(圖2B，見封二)，病毒所攜帶的IL-10 基因在啟動子Iba1 的驅(qū)動下在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)IL-10。腺相關(guān)病毒注射21 d 后顯示IL-10 在SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(圖2C1～C2，見封二)。

圖2 實(shí)驗(yàn)流程及IL-10 在SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 小鼠SNc 多巴胺能神經(jīng)元的凋亡 免疫熒光組織化學(xué)染色顯示各組小鼠SNc 多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)密度發(fā)生了顯著的變化(F(3,36)=25.267,P＜0.001)。與正常組相比較，PD 模型組小鼠SNc 多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生了顯著的凋亡(P＜0.001)；與PD 模型組相比，PD模型小鼠微量注射對照病毒沒有顯著影響SNc 多巴胺能神經(jīng)元的凋亡(P＞0.05)，而SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)IL-10 顯著地緩解了SNc 多巴胺能神經(jīng)元的凋亡(P＜0.001)(圖3，見封二)。

圖3 各組SNc 多巴胺能神經(jīng)元凋亡的比較

2.3 小鼠SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞的面積密度 免疫熒光組織化學(xué)染色顯示各組小鼠SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞的面積密度發(fā)生了顯著的變化(F(3,36)=85.533,P＜0.001)。與正常組比較，PD 模型小鼠SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞的面積密度顯著升高(P＜0.001)；與PD 模型組比較，PD 模型小鼠微量注射對照病毒對SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞的面積密度沒有顯著影響(P＞0.05)，而SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)IL-10 顯著地緩減了SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞的活化(P＜0.001)(圖4，見封二)。

圖4 各組SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的比較

2.4 PD 模型小鼠SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)IL-10 改善運(yùn)動障礙 應(yīng)用自制挑戰(zhàn)平衡木裝置測試顯示，各組小鼠穿過挑戰(zhàn)平衡木的步數(shù)(F(3,36)=23.76,P＜0.001)、踩踏的錯誤率(F(3,36)=5.927,P=0.002)及穿越平衡木的時間(F(3,36)=7.94,P＜0.001)均發(fā)生了顯著的變化。與正常組相比較，PD 模型小鼠穿過挑戰(zhàn)平衡木的步數(shù)顯著增加(P＜0.001)，踩踏的錯誤率顯著升高(P＜0.01)，穿越平衡木的時間也顯著延長(P＜0.01)。與PD 模型組比較，PD 模型小鼠微量注射對照病毒的小鼠穿過挑戰(zhàn)平衡木的步數(shù)、踩踏的錯誤率及穿越平衡木的時間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)；而PD 模型小鼠SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)IL-10 顯著增加小鼠穿過挑戰(zhàn)平衡木的步數(shù)(P＜0.001)、踩踏的錯誤率(P＜0.05)及穿越平衡木的時間(P＜0.01)。

圖5 SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)IL-10 改善PD 模型小鼠運(yùn)動障礙

3 討論

PD 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前多認(rèn)為其可能與老化、遺傳和環(huán)境等因素有關(guān)。近年來越來越多的研究[1,6,12-13]證實(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活與PD 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。小膠質(zhì)細(xì)胞來源于間充質(zhì)中胚層的巨噬細(xì)胞，形態(tài)上主要分為分枝狀和阿米巴狀，前者為未被激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞，后者為活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞。在PD 病理進(jìn)程中，受損的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元能夠釋放TNF-α 及γ 干擾素(interferon-γ,IFN-γ)等炎癥因子，激活SNc 中的小膠質(zhì)細(xì)胞，其分泌的TNF-α、IFN-γ 及IL-1β 等炎癥因子進(jìn)一步激活周圍的其他小膠質(zhì)細(xì)胞[3-4,12]。此外，與PD 密切相關(guān)的路易小體的主要成分α-突觸核蛋白也對小膠質(zhì)細(xì)胞具有直接的激活作用。激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過形態(tài)的改變吞噬α-突觸核蛋白，活化還原型的輔酶Ⅱ，還原型輔酶Ⅱ的激活又可以導(dǎo)致活性氧簇和細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的合成增加，進(jìn)而加速了神經(jīng)元的凋亡過程[13-14]。

大量研究[4,7,13]表明，PD 病理進(jìn)程中抑炎因子IL-10 通過其典型的抗炎和抗凋亡的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制參與PD 運(yùn)動調(diào)控。臨床研究[9]顯示，PD 患者血清內(nèi)IL-10 的含量顯著升高。IL-10 基因啟動子多態(tài)性與PD 患者的發(fā)病年齡相關(guān)[14]。腦內(nèi)微量注射表達(dá)含人源IL-10 基因的慢病毒能夠緩解動物前肢的運(yùn)動障礙[15]；IL-10 基因敲除小鼠腹腔注射脂多糖后其運(yùn)動協(xié)調(diào)能力與野生型小鼠相比顯著地惡化[16]。這些臨床與基礎(chǔ)研究提示：IL-10 很可能在腦內(nèi)通過其抗炎和抗凋亡作用發(fā)揮重要的運(yùn)動調(diào)控功能，并在PD運(yùn)動障礙的改善中發(fā)揮重要作用。

本研究利用腺相關(guān)病毒過表達(dá)技術(shù)，選擇性地在PD 模型小鼠SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)IL-10。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，PD 模型小鼠SNc 多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生了顯著的凋亡且小膠質(zhì)細(xì)胞的面積密度顯著增加；與PD 模型組相比較，SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)IL-10 顯著地減少SNc 多巴胺能神經(jīng)元的凋亡且降低小膠質(zhì)細(xì)胞的面積密度。結(jié)果表明，SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)IL-10 能夠減輕PD 模型小鼠SNc 多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)退變及小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥。進(jìn)一步采用挑戰(zhàn)平衡木測試發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，PD 模型小鼠穿過挑戰(zhàn)平衡木的步數(shù)、踩踏的錯誤率及穿越平衡木的時間均顯著增多；與PD 模型組比較，SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)IL-10 小鼠穿過挑戰(zhàn)平衡木的步數(shù)、踩踏的錯誤率以及穿越平衡木的時間均顯著增加。綜合以上結(jié)果表明，SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)IL-10 通過抑制PD 模型小鼠SNc 小膠質(zhì)細(xì)胞的活化從而發(fā)揮對多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)退變的保護(hù)作用，進(jìn)而在動物行為學(xué)水平上改善PD 模型小鼠的運(yùn)動障礙。本研究提示抑炎因子IL-10 對神經(jīng)退變的保護(hù)作用及神經(jīng)炎癥的抑制作用可望發(fā)展成為臨床上PD 治療的新靶點(diǎn)。