長(zhǎng)鏈非編碼RNA FTX通過(guò)PPARγ影響腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和糖酵解

馬晶晶 楊金蘭 屈天銀 喻皇飛

遵義市第一人民醫(yī)院（遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院）1檢驗(yàn)科，2腫瘤科（貴州遵義 563000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率在我國(guó)呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人民群眾健康［1］。在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，隨著瘤體逐漸增大及腫瘤內(nèi)環(huán)境的改變，癌細(xì)胞利用葡萄糖供能從有氧糖代謝轉(zhuǎn)向有氧糖酵解，使得其在相對(duì)缺氧的狀態(tài)下適應(yīng)環(huán)境的改變而持續(xù)增殖生長(zhǎng)，從而產(chǎn)生瓦伯格效應(yīng)（warburg effect），是實(shí)體惡性腫瘤的重大生物學(xué)特征之一［2］。所以，從癌細(xì)胞糖能量代謝的角度入手深入研究CRC 的發(fā)病機(jī)制，對(duì)健康中國(guó)戰(zhàn)略下的CRC 防治具有重要意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是生物體內(nèi)長(zhǎng)度超過(guò)200 bp 的、不具備蛋白質(zhì)編碼功能的一類RNA［3］。研究［4］證實(shí)LncRNA 在腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。LncFTX 是由位于X 染色體失活區(qū)域（X chromosome inactivation，XCI）的非蛋白質(zhì)編碼基因FTX（five prime to Xist）轉(zhuǎn)錄而來(lái)，由2 300 bp 組成［5］。FTX 在進(jìn)化上高度保守，位于人染色體X q13.2 區(qū)域，曾一度被認(rèn)為是“無(wú)用的廢棄基因”。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)LncFTX 在惡性膠質(zhì)瘤［6］、肝癌［7］、胃癌［8］以及肺癌［9］等多種腫瘤中作為促癌因子存在，刺激癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。LncFTX 同樣在腸癌組織中異常表達(dá)［10］，但其與腸癌細(xì)胞糖能量代謝之間的關(guān)系不是十分清楚。本研究擬探索LncFTX 在腸癌細(xì)胞中對(duì)葡萄糖代謝和癌細(xì)胞增殖遷移行為的影響，為深究其參與腸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與主要試劑腸癌細(xì)胞株HT-29、SW480、HCT116 以及正常腸黏膜上皮細(xì)胞株NCM-460細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自GIBCO 公司；轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000 購(gòu)自Invitrogen 公司；PPARγ、PDHA1、Glut4、TNF α、Leptin 兔抗人多克隆抗體均來(lái)自ABclonal公司；HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗來(lái)自武漢博士德公司，RIPA 裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，pcDNA3.1 PPARγ 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及相應(yīng)空載體購(gòu)自湖南優(yōu)寶生物科技有限公司；siRNAs 購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；PPARγ 激動(dòng)劑Pioglitazone購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；果糖磷酸激酶（PFK）檢測(cè)試劑盒、檸檬酸合成酶（CS）檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意并批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染腸癌HT-29、SW480、HCT 116 細(xì)胞株及正常腸黏膜上皮細(xì)胞NCM-460 細(xì)胞均用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基（含雙抗）在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天按2 × 104個(gè)/mL 密度種植于六孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)到一定密度（60%～70%）時(shí)，參照Lipofectamine 2000 試劑說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別將si-FTX、si-NC 及pcDNA3.1 PPARγ 及相應(yīng)陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HT-29 細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染6 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。所用si-LncFTX 干擾序列：Forward 5'-GCUGAAACUUCAGUACUUATT-3'，Reverse 5'-UAAGUACUGAAGUUUCAGCTT-3'。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，嚴(yán)格按照RNA 抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)要求提取總RNA，進(jìn)行核酸定量，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。最后按qRT-PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行LncFTX 和PPARγ 檢測(cè)。用2-△△Ct法計(jì)算兩者相應(yīng)mRNA 的表達(dá)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 所用引物序列Tab.1 Sequence of primers used in the experiment

1.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)按CCK-8試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，具體步驟如下：收集各組細(xì)胞，按5 × 103個(gè)/孔接種于96 孔板中，各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)液并加入10 μL CCK-8 溶液，輕微混勻，在37 ℃孵箱內(nèi)孵育2 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm 處的吸光度（A450）值。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，將對(duì)照組的OD值標(biāo)定為100%，根據(jù)實(shí)驗(yàn)各組與對(duì)照組的OD值比值，算出各組的相對(duì)增殖速度。以上實(shí)驗(yàn)做3 次重復(fù)。

1.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力取處理好的HT-29 細(xì)胞，0.25%胰酶分別消化收集，無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至3 ×105個(gè)/mL 備用。在24 孔板中預(yù)先加入800 μL 10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，并放入Transwell 小室，1 h后在Transwell 上室分別接入200 μL 各組細(xì)胞懸液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后取出transwell小室，用PBS 小心清洗小室，用70%冰乙醇溶液固定細(xì)胞后以0.5%結(jié)晶紫染液在室溫條件下染色20 min，PBS 洗滌后用干凈的棉球?qū)⑸鲜乙粋?cè)的未遷移的細(xì)胞擦干凈，置于顯微鏡下觀察拍照。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（western blot，WB）收集經(jīng)處理后的細(xì)胞，PBS 洗滌后每孔加入80 μL通用型蛋白裂解液提取蛋白，進(jìn)行蛋白濃度定量。分別配制12%的分離膠、5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離目標(biāo)蛋白，PVDF膜轉(zhuǎn)膜后利用5%脫脂奶粉封閉2 h；然后分別加入一抗PPARγ（1∶1 000）、PDHA1（1∶1 000）、Glut4（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、Leptin（1∶1 000）4 ℃過(guò)夜，用含Tween-20 的Tris-HCl 緩沖鹽溶液（TBST）洗膜3 次，每次10 min；按1∶5 000 的比例加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗，在室溫下孵育2 h 后，TBST 洗膜3 次，用ECL 顯色液顯色，Image J 軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA分析）按照PFK、

LDH、CS 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行各組細(xì)胞中PFK、LDH、CS 含量檢測(cè)。多功能酶標(biāo)儀測(cè)各組OD值，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。受測(cè)樣本OD=（測(cè)定OD-對(duì)照OD）/（標(biāo)準(zhǔn)OD-空白OD）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncFTX 促進(jìn)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移利用

RT-qPCR 檢測(cè)LncFTX 在正常腸黏膜上皮NCM-460 細(xì)胞和腸癌HT-29、HCT116 和SW480 三種不同瘤株細(xì)胞中本底表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在三種腸癌細(xì)胞中的表達(dá)均明顯高于正常腸粘膜細(xì)胞。相比而言，LncFTX 在HT29 細(xì)胞中的本底表達(dá)水平最高（圖1A）。故此選擇在HT-29 細(xì)胞中利用siRNA 干擾LncFTX的表達(dá)（圖1B），發(fā)現(xiàn)下調(diào)LncFTX表達(dá)后的HT29細(xì)胞的增殖（圖1C）和遷移能力（圖1D-1E）均受到了明顯抑制。結(jié)果提示LncFTX 不僅在腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，還參與了HT-29 細(xì)胞的增殖和遷移行為。

圖1 LncFTX 促進(jìn)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移Fig.1 LncFTX promotes the proliferation and migration of colorectal cancer cells

2.2 LncFTX 促進(jìn)腸癌細(xì)胞有氧糖酵解過(guò)程為進(jìn)一步驗(yàn)證LncFTX 對(duì)HT-29 腸癌細(xì)胞糖能量代謝過(guò)程的影響，利用siRNA 下調(diào)LncFTX 表達(dá)后發(fā)現(xiàn)HT-29 細(xì)胞中Glut4 表達(dá)明顯減少（圖2A），但PDHA1 卻明顯升高。同時(shí)ELISA 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PFK和LDH 的含量分別為（0.14 ± 0.02）U/mg 和（72.03± 14.64）U/L，均明顯低于空白組和干擾對(duì)照組（P＜0.05）。而CS 的含量則明顯升高，從對(duì)照組的（4.22±0.20）U/mg升至（8.07±0.50）U/mg（P＜0.05，圖2B-D）。提示下調(diào)LncFTX 可能使得HT-29 細(xì)胞的葡萄糖攝入下降，細(xì)胞內(nèi)乳酸生成減少，同時(shí)讓細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖進(jìn)入三羧酸循環(huán)代謝。

圖2 LncFTX 促進(jìn)腸癌細(xì)胞有氧糖酵解過(guò)程Fig.2 LncFTX promotes aerobic glycolysis of colorectal cancer cells

2.3 LncFTX調(diào)節(jié)PPARγ及其下游基因的表達(dá)通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)LncFTX 可能與PPARγ關(guān)聯(lián)，提示LncFTX 對(duì)HT-29 細(xì)胞的糖能量代謝與其對(duì)PPARγ 的調(diào)控有關(guān)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下調(diào)HT-29 細(xì)胞中LncFTX 表達(dá) 后，PPARγ 無(wú)論是在mRNA 水平（圖3A）還是在蛋白水平均較空白和對(duì)照組明顯下降。而Leptin、TNFα 作為下游蛋白，受到PPARγ 的負(fù)調(diào)控，在LncFTX 被抑制后兩者的表達(dá)則明顯升高（圖3B）。

圖3 LncFTX 調(diào)節(jié)PPARγ 及其下游基因的表達(dá)Fig.3 LncFTX regulates the expression of PPARγ and its downstream genes

2.4 PPARγ 介導(dǎo)了LncFTX 對(duì)腸癌細(xì)胞的糖酵解干擾LncFTX 后的HT-29 細(xì)胞，經(jīng)10 μmol/L Pioglitazone（PPARγ 特異性激動(dòng)劑）處理后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)CS 的含量則由（7.11±0.54）U/mg 變?yōu)椋?.21±0.27）U/mg，較si-LncFTX 組明顯下降（P＜0.05）；而下降的PFK 及LDH 含量均得以有效逆轉(zhuǎn)，分別從（0.10±0.01）U/mg、（61.37 ± 6.70）U/L 升至（0.14 ±0.02）U/mg、（100.83 ± 9.66）U/L，較si-LncFTX 組顯著升高（均P＜0.05，圖4A）。為進(jìn)一步驗(yàn)證PPARγ在糖代謝調(diào)節(jié)中的作用，利用過(guò)表達(dá)PPARγ 載體轉(zhuǎn)染HT-29 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPARγ 能夠明顯激活PFK和LDH的活性，單純PPARγ過(guò)表達(dá)組HT-29細(xì)胞內(nèi)的PFK 和LDH 活性分別為（0.29 ± 0.02）U/mg和（170.43 ± 11.83）U/L，明顯高于si-Ctr 組（0.16 ±0.01）U/mg、（109.07 ± 6.70）U/L 和si-LncFTX 組；CS的活性則明顯受到抑制［（1.75 ± 0.35）U/mg］，顯著低于si-Ctr 組和si-LncFTX 組。但同時(shí)轉(zhuǎn)染si-LncFTX 和PPARγ 組細(xì)胞中的PFK 和LDH 含量較單純PPARγ 過(guò)表達(dá)組仍有所下降，其含量分別是（0.20 ± 0.01）U/mg 和（132.36 ± 11.24）U/L，而CS 含量卻有升高［（3.07±0.08）U/mg，圖4B］。

WB 實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或利用PPARγ 特異性激動(dòng)劑Pioglitazone 上調(diào)HT-29 細(xì)胞中PPARγ 表達(dá)后明顯可逆轉(zhuǎn)LncFTX 對(duì)PPARγ 的影響，但其下游蛋白Leptin、TNFα 則出現(xiàn)與PPARγ相反的升高現(xiàn)象。Glut4的表達(dá)與細(xì)胞中PPARγ表達(dá)變化一致，但PDHA1 則在HT-29 細(xì)胞si-LncFTX時(shí)最高，PPARγ過(guò)表達(dá)及Pioglitazone 處理后有一定程度的下降（圖4C）。這些結(jié)果均提示PPARγ 除對(duì)下游Leptin、TNFα 有明顯影響外，還可調(diào)節(jié)代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)參與腸癌細(xì)胞的糖耐量代謝過(guò)程。

圖4 PPARγ 參與LncFTX 對(duì)腸癌細(xì)胞的糖酵解Fig.4 PPARγ participates in the glycolysis of colon cancer cells induced by LncFTX

3 討論

LncFTX 作為XCI 區(qū)域的非編碼RNA 及重要的表觀遺傳調(diào)控因子，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生進(jìn)展［11］。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也顯示LncFTX 可作為腸癌的促癌因素而存在，除了促進(jìn)腸癌細(xì)胞的增殖遷移外，還可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的糖酵解過(guò)程，改變腫瘤的能量供給，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)。

PPARγ 作為過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體家族重要成員之一，PPARγ 還可以通過(guò)調(diào)控代謝途徑促進(jìn)腫瘤進(jìn)程，被視為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)［12］。TEW 等［13］發(fā)現(xiàn)，前列腺癌中抑制PPARγ 后，會(huì)降低其下游脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）的表達(dá)，減緩前列腺癌的發(fā)展。在肝癌細(xì)胞中，PPARγ的激活能夠增加糖酵解水平，最終促進(jìn)肝癌的發(fā)生［14］。本研究結(jié)果顯示，在腸癌細(xì)胞中PPARγ可作為L(zhǎng)ncFTX 的下游蛋白并受之調(diào)控，這與LI等［14］在肝癌中的研究相似，說(shuō)明LncFTX 能夠通過(guò)PPARγ 調(diào)控不同癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。利用siRNA 下調(diào)HT29 細(xì)胞中LncFTX 后，除PPARγ 受抑制外，介導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的Glut4 表達(dá)下降，但PDHA1 的表達(dá)卻明顯升高。Glut4 是細(xì)胞葡萄糖攝取的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其表達(dá)異?？芍率刮赴┨墙徒獍l(fā)生和腫瘤進(jìn)展［15］，而PDHA1 作為丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的關(guān)鍵亞基，活性的下降有利于細(xì)胞內(nèi)有氧糖酵解（即Warburg 效應(yīng)）［16］，而其表達(dá)上調(diào)則可逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的Warburg 效應(yīng)［17］。從隨后對(duì)細(xì)胞內(nèi)CS 及PFK、LDH 的活性和含量分析來(lái)看，LncFTX 通過(guò)PPARγ調(diào)節(jié)腸癌細(xì)胞的有氧糖酵解過(guò)程在過(guò)表達(dá)PPARγ或利用PPARγ 激動(dòng)劑后得到部分逆轉(zhuǎn)，也證實(shí)了PPARγ 在介導(dǎo)LncFTX 對(duì)腸癌糖酵解過(guò)程中的重要作用。

Leptin 作為PPARγ 下游的脂性因子，可反映細(xì)胞對(duì)胰島素抵抗的敏感性，而TNFα 則在脂肪因子誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性反應(yīng)中起重要作用，兩者均受PPARγ 的負(fù)調(diào)控［18］。在本實(shí)驗(yàn)中，HT-29 細(xì)胞中的LncFTX 表達(dá)被下調(diào)后，作為下游的Leptin 和TNFα 隨著PPARγ 的抑制而升高，該現(xiàn)象在過(guò)表達(dá)PPARγ 后即被有效逆轉(zhuǎn)，提示LncFTX 還有可能通過(guò)PPARγ 影響癌細(xì)胞的脂肪代謝過(guò)程。

LncFTX 對(duì)癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)多是通過(guò)海綿吸附不同miRNA 調(diào)控細(xì)胞內(nèi)靶基因的表達(dá)而得以實(shí)現(xiàn)［7-9］，本研究中LncFTX 對(duì)PPARγ 調(diào)控的分子機(jī)制是否涉及miRNA 的參與尚不清楚。本研究通過(guò)核苷酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)LncFTX 與PPARγ 之間存在一定的互補(bǔ)結(jié)合序列的結(jié)果來(lái)看，LncFTX還有可能直接與mRNA 結(jié)合影響PPARγ的翻譯過(guò)程。但LncFTX 對(duì)PPARγ 的影響究竟是直接與其mRNA 作用還是通過(guò)某些miRNAs 實(shí)現(xiàn)的，有待后續(xù)進(jìn)一步的研究證實(shí)。