基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)檢測支氣管肺泡灌洗液對涂陰或無痰肺結(jié)核的診斷價值

侯婧 王華 劉盛盛

安徽省胸科醫(yī)院結(jié)核科（合肥 230022）

肺結(jié)核（PTB）是威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題［1］。我國2020年結(jié)核發(fā)病人數(shù)約84.2 萬人，居全球第二，結(jié)核病負(fù)擔(dān)較重［2］。傳統(tǒng)的痰液抗酸染色能夠快速診斷結(jié)核病，但其陽性率小于30%，且部分患者無痰或留取痰液標(biāo)本不規(guī)范，也影響了診斷率。這部分無痰或涂片陰性（涂陰）的PTB 患者約占總數(shù)的70%，快速、準(zhǔn)確的對其做出診斷，對降低病死率、改善預(yù)后、控制結(jié)核傳播至關(guān)重要，是目前結(jié)核病防治的重要任務(wù)［3］。臨床常用支氣管肺泡灌洗液（BALF）檢測以克服影響痰液標(biāo)本采集的諸多影響因素，提高疾病診斷率［4］。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法（MALDI-TOF MS）是一種新型細(xì)菌鑒定技術(shù)，其準(zhǔn)確性高、操作便捷、成本低廉，近年來已逐漸應(yīng)用于臨床多種病原微生物的鑒定［5-7］。但該技術(shù)對涂陰或無痰PTB 的BALF 檢測診斷價值研究尚未見報道。本研究運(yùn)用MALDI-TOF MS 對安徽省胸科醫(yī)院收治的87 例涂陰或無痰疑似PTB 患者BALF 進(jìn)行檢測，探究其診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2020年1月至2021年12月安徽省胸科醫(yī)院住院診療的87 例涂陰或無痰的疑似PTB 患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）胸部影像學(xué)檢查疑似PTB；（2）痰抗酸染色至少連續(xù)3 次陰性或無痰；（3）無纖維支氣管鏡檢查禁忌，且同意該檢查；（4）同意BALF 送檢MALDI-TOF MS、SAT-TB、Gene-Xpert 檢測以及BD960 培養(yǎng)。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 涂陰或無痰肺結(jié)核診斷本研究中診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《WS288-2017 肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》［8］制定，3 次痰涂片陰性或無痰，胸部影像學(xué)符合PTB 改變，且符合下列條件之一：（1）有咳嗽、咳痰、咯血等結(jié)核可疑癥狀；（2）皮膚結(jié)核菌素試驗陽性或強(qiáng)陽性，或γ-干擾素釋放試驗陽性，或結(jié)核抗體陽性；（3）經(jīng)診斷性抗結(jié)核藥物治療且隨訪觀察有效者。

1.2.2 其他肺部疾病的診斷參照第九版《內(nèi)科學(xué)》中呼吸系統(tǒng)疾病章節(jié)［9］，臨床診斷為其他肺部疾病者。

1.3 BALF 收集方法患者于我院內(nèi)鏡中心行氣管鏡檢查采集BALF，應(yīng)用奧林巴斯BF1T206 纖維支氣管鏡，在胸部CT 提示病灶相應(yīng)的支氣管肺段注入0.9%NaCl 10～20 mL進(jìn)行灌洗，負(fù)壓吸引回收BALF 至無菌瓶。送我院檢驗科行SAT-TB、Gene-Xpert 檢測及BD960 培養(yǎng)，上海康黎公司行MALDITOF MS 檢測。

1.4 BALF檢驗方法（1）MALDI-TOF MS：應(yīng)用美國Agena 核酸質(zhì)譜分析系統(tǒng)MassARRAY 進(jìn)行檢測，先對BALF 常規(guī)生物滅活，配置反應(yīng)液5 μL，進(jìn)行PCR 引物擴(kuò)增，后去除脫氧核糖核苷三磷酸，再進(jìn)行檢測位點(diǎn)的單堿基延伸反應(yīng)，經(jīng)處理后檢測。（2）SAT-TB：采用上海仁度生物科技有限公司試劑盒，提取約2 mL 標(biāo)本經(jīng)處理后超聲破碎15 min，取標(biāo)本于恒溫?zé)晒鈾z測儀上檢測。（3）Gene Xpert：設(shè)備和試劑盒由美國Cepheid 公司生產(chǎn)，標(biāo)本經(jīng)消化等處理，儀器自動進(jìn)行過濾和洗滌，超聲溶菌并釋放出DNA 后與PCR 反應(yīng)試劑混合并檢測。（4）BD960：采用美國BD 公司BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)儀，標(biāo)本處理后接種于分枝桿菌培養(yǎng)瓶中進(jìn)行液體培養(yǎng)［10］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，一般資料比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。各檢驗方法的診斷效能，如敏感性等比較采用χ2檢驗及事后兩兩比較。運(yùn)用Medcalc 19.0.4 繪制受試者工作特征（ROC）曲線，以曲線下面積（AUC）評估不同檢測方法的診斷價值，并采用Delong 法進(jìn)行比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料87 例疑似PTB 患者納入研究。根據(jù)最終診斷，結(jié)核組共54 例，男27 例，女27 例，年齡16～72 歲。其他肺部疾病組共33 例，男19 例，女14 例，年齡22～74 歲。兩組患者的性別、年齡、癥狀等一般資料見表1。

表1 87 例疑似肺結(jié)核患者的一般資料Tab.1 Profiles of 87 patients with suspected pulmonary tuberculosis例

2.2 4 種檢測方法的診斷效能MALDI-TOF MS、SAT-TB、Gene-Xpert 及BD960 法診斷特異性均＞95.0%；敏感性分別為68.5%（37/54）、13.0%（7/54）、40.7%（22/54）和27.8%（15/54）；陽性預(yù)測值分別為97.4%（32/33）、87.5%（7/8）、100.0%（22/22）和100.0%（15/15）；陰性預(yù)測值分別為65.3%（32/49）、40.5%（32/79）、50.8%（33/65）和45.8%（33/72）。4 種檢測方法的敏感性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=38.459，P＜0.001），兩兩比較發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS 診斷的敏感性優(yōu)于SAT-TB、Gene-Xpert 和BD960 法（P＜0.05）。見表2。

表2 4 種檢測方法對涂陰或無痰肺結(jié)核的診斷效能Tab.2 The diagnostic efficacy of four testing methods for smear-negative or sputum-scarce pulmonary tuberculosis

2.3 4 種檢測結(jié)果ROC 曲線分析進(jìn)一步采用ROC 曲線對各檢測方法的診斷效能進(jìn)行評價。MALDI-TOF MS、SAT-TB、Gene-Xpert 及BD960 法的AUC值分別為0.827、0.550、0.704和0.639。MALDI-TOF MS 法的AUC 值最高，明顯優(yōu)于其他3 種檢測方法（Z=8.139、3.608 和5.097，均P＜0.01），見圖1。

圖1 4 種檢測方法ROC 曲線分析Fig.1 ROC curves of four testing methods

2.4 MALDI-TOF MS 法與其他方法的聯(lián)合診斷效能MALDI-TOF MS 法分別與SAT-TB 法、Gene-Xpert 法和BD960 法聯(lián)合診斷的AUC 為0.836、0.834 和0.832。聯(lián)合診斷方法與單一MALDI-TOF MS法AUC的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=0.993、0.987和0.976，P=0.32、0.32和0.33），見圖2。

圖2 MALDI-TOF MS 法與其他方法的聯(lián)合診斷的ROC曲線分析Fig.2 ROC curves of joint diagnosis by combining MALDITOF MS with other methods

3 討論

目前臨床上對涂陰或無痰PTB 缺少快速、簡便、有效的檢測方法。分枝桿菌培養(yǎng)是其診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但耗時2～6 周，且受接種技術(shù)、培養(yǎng)基質(zhì)量、孵化時間等多因素影響，不能滿足臨床早期、高效診斷的需求［11］。近年來分子檢測技術(shù)逐步應(yīng)用于PTB 診斷，提高了早期診斷率［12］。常見方法包括RNA 恒溫擴(kuò)增實時熒光檢測（SAT-TB）、結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測（Gene-xpert），但其對于涂陰結(jié)核的診斷率仍較低，且操作繁瑣、實驗室要求高，難以滿足臨床需求［13-14］。

MALDI-TOF MS 是一種新型軟電離生物質(zhì)譜，其原理是在基質(zhì)輔助下使結(jié)合后的分子發(fā)生電離，在電場作用下加速通過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的時間不同進(jìn)行鑒別。從激光發(fā)射到信號檢測的過程只需幾毫秒，故可在不到50 min 的時間內(nèi)對384 個樣本進(jìn)行分析。這種對復(fù)雜生物樣本中的痕量核酸進(jìn)行的檢測，具有通量高、速度快、成本低的特點(diǎn)［15］。美國Agena Bioscience 公司MassARRAY@MALDI-TOF MS 于2018年被批準(zhǔn)用于臨床核酸檢測，其不依賴于熒光探針和熒光類試劑的檢測流程，克服了PCR 技術(shù)多重擴(kuò)增能力不足的問題，解決了基因組檢測中多個變異位點(diǎn)同時檢測的需求［16］，且檢測周期遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的一代、二代測序（≥18 h），對少量標(biāo)本也能夠進(jìn)行多基因多位點(diǎn)的檢測［17-19］，滿足了臨床檢測的需求。

已有不少研究證實該技術(shù)檢測結(jié)核菌的準(zhǔn)確性：CAO等［20］對國內(nèi)外19項MALDI-TOF MS分枝桿菌鑒定研究進(jìn)行Meta分析，涉及2 593株分離株，發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS 鑒定結(jié)核菌的符合率為92%。有研究比較了MALDI-TOF MS、核酸雜交和MTB64免疫分析試驗鑒定結(jié)核菌和非結(jié)核分枝桿菌的效果，MALDI-TOF MS 鑒定的符合率為88%，且鑒定時間僅需45 min，而核酸雜交需要6～7 h［21］。LUO等［22］的研究中，MALDI-TOF-MS 對507 株分枝桿菌分離株進(jìn)行鑒定，正確率達(dá)到93.9%。但該技術(shù)檢測涂陰或無痰PTB 患者BALF 標(biāo)本的臨床研究未見報道。臨床工作中許多疑似肺結(jié)核患者，反復(fù)查痰涂片陰性，或在醫(yī)師指導(dǎo)下仍無法留取合格的痰液標(biāo)本，故本研究采用BALF 為研究標(biāo)本，分別進(jìn)行MALDI-TOF MS、SAT-TB、Gene-Xpert 檢測以及BD960 培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，以上各方法均具有極佳的診斷特異性。MALDITOF MS敏感性為68.5%（37/54），明顯高于SAT-TB、Gene-Xpert 及BD960 的13.0%（7/54）、40.7%（22/54）及27.8%（15/54）?？紤]其利用了多重PCR 技術(shù)，在同一個反應(yīng)中可同時檢測高達(dá)40個變異位點(diǎn)，且基于分子量的質(zhì)譜檢測方式提供了不依賴于熒光信號的檢測準(zhǔn)確度，大大提高了檢測效能。

本研究中仍有31.5%的患者核酸質(zhì)譜檢測為陰性，考慮可能是：（1）BALF 中的結(jié)核菌量過少，經(jīng)擴(kuò)增后仍無法達(dá)到檢測所需量；（2）其檢測敏感度標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)譜圖庫尚不能覆蓋所有分枝桿菌。以上原因可能導(dǎo)致了MALDI-TOF MS的檢測結(jié)果與臨床診斷不一致。通過多次灌洗提高BALF 菌量，或自建臨床菌株質(zhì)譜圖庫，增加質(zhì)譜圖庫范圍，可進(jìn)一步提高M(jìn)ALDI-TOF MS 的菌種鑒定能力。而在33 例非結(jié)核患者中僅有1 例MALDI-TOF MS 陽性，經(jīng)臨床分析考慮為假陽性，其特異性為97.0%，提示該方法診斷PTB 具有高度準(zhǔn)確性。產(chǎn)生假陽性的可能原因分析如下：（1）在BALF 分裝送檢、支氣管鏡消毒或?qū)嶒炇也僮鬟^程中造成污染所致；（2）對近緣菌株的分辨率有限，偶有少量菌株被誤判為結(jié)核分枝桿菌。提示在支氣管鏡消毒、BALF留取、標(biāo)本分裝及送檢、實驗室操作環(huán)節(jié)中應(yīng)嚴(yán)格各項操作規(guī)范，避免人為因素而出現(xiàn)假陽性。

本研究中，MALDI-TOF MS、SAT-TB、Gene-Xpert和BD960 法的AUC 值分別為0.827、0.550、0.704 和0.639。其AUC 值優(yōu)于其他3 種檢測方法。進(jìn)一步采用ROC 曲線分析了MALDI-TOF MS 分別聯(lián)合其他3 種檢測方法的診斷效能，發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS單獨(dú)診斷涂陰或無痰PTB 的AUC 和聯(lián)合診斷的AUC 相比均無明顯差異。這說明臨床上可單獨(dú)采用MALDI-TOF MS 法進(jìn)行輔助診斷，避免聯(lián)合多種檢測手段帶來的醫(yī)療資源消耗。

綜上所述，MALDI-TOF MS 法對涂陰或無痰PTB 具有較好的輔助診斷價值和臨床應(yīng)用前景。本研究存在一定局限性，為單中心、小樣本的研究，且樣本量有限。今后可考慮多中心、大樣本研究，以進(jìn)一步驗證其診斷價值。并擴(kuò)大標(biāo)本類型，如胸腔積液、膿液、腦脊液等，探索該技術(shù)對肺外結(jié)核的診斷價值。