PRDM1和GATA2基因mRNA作為活動性結核和潛伏感染鑒別診斷標志物的可能性研究

劉艷華 王若 楊秉芬 曹志紅 翟斐 孫雯娜 蘇瑾文 俞珊 程小星

解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心結核病醫(yī)學部1全軍結核病防治重點實驗室，結核病診療新技術北京市重點實驗室，2結核科（北京 100091）

結核?。╰uberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）感染引發(fā)的慢性傳染性疾病，嚴重威脅人類健康。2020年WHO全球結核病報告顯示我國是30 個結核病高負擔國家之一，結核病發(fā)病例數(shù)居全球第三位，結核病是我國需要重點防控的重大傳染?。?］。

人類感染M.tb 后，多數(shù)呈現(xiàn)帶菌生存狀態(tài)，并不會發(fā)展為結核病，稱為潛伏感染者（latent tuberculosis infection，LTBI）；約5%～10%的LTBI會繼續(xù)發(fā)展為活動性結核病（active tuberculosis，ATB）。國內流行病學調查結果顯示，基于γ-干擾素釋放試驗（IFN-gamma release assay，IGRA）得出的M.tb感染率大約在20%～30%之間，即全國約有3～4 億人為M.tb 感染者［1］，數(shù)目龐大的無臨床癥狀的LTBI 是ATB 的重要來源。此外，由于LTBI 的預防性治療方案與ATB 的抗癆治療方案顯著不同。因此，如何實現(xiàn)LTBI 與ATB 的早期鑒別診斷至關重要。

常用的M.tb 感染診斷方法包括傳統(tǒng)的結核菌素實驗（TST）以及IGRAs，TST 方法容易受到卡介苗接種和非結核分枝桿菌的干擾，MTB 感染診斷不夠明確，更無法區(qū)別LTBI 和ATB。新近推行的IGRAs 方法，雖然能夠檢測MTB 感染，但無法區(qū)分LTBI 和ATB。近年來雖然陸續(xù)出現(xiàn)了一些先進的基于核酸擴增的分子生物學檢測技術（如XpertMTB/RIF assay），但由于受到儀器設備和診斷費用的限制，以及假陽性率偏高等問題，還無法全面推廣。因此，現(xiàn)行的結核病診斷方法或輔助診斷手段都無法實現(xiàn)快速有效的LTBI 和ATB 鑒別診斷，使得臨床上面臨嚴重的治療延誤以及過度治療等問題?；谏鲜霈F(xiàn)狀，尋找新的TB 特異標志物，鑒別診斷LTBI 和ATB，已經成為結核病臨床診斷中一項亟待解決的難題［1］。

我們前期的轉錄組測序實驗發(fā)現(xiàn)ATB 和健康人外周血中PRDM1 和GATA2 基因mRNA 表達存在顯著差異。PRDM1 是轉錄因子blimp-1 的編碼基因，blimp-1 能調控包括B 細胞、T 細胞、樹突細胞、巨噬細胞和NK 細胞在內的多種免疫細胞的發(fā)育和分化。PRDM1 的基因多態(tài)性與多種自身免疫疾?。ㄈ缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎和炎癥性腸病）和淋巴瘤的發(fā)生密切相關［2-4］。GATA2 是轉錄因子GATA2 的編碼基因，GATA2 基因突變導致的GATA2 蛋白功能缺陷是造成MonoMAC 綜合征、原發(fā)性淋巴水腫伴有骨髓異常增生綜合征（emberger syndrome）、樹突、單核和B/NK 淋巴細胞缺乏征（DCML）和家族聚集性骨髓增生異常綜合癥/急性淋巴細胞白血病（MDS/AML）的遺傳原因［5-6］。

PRDM1和GATA2與結核病的關系鮮有報道［7］。為了進一步了解PRDM1 和GATA2 在ATB 中的表達情況，以及它們作為結核病診斷標志物的價值，本研究通過熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，qPCR）方法在新的受試者中檢測這兩個基因的mRNA 表達，并利用受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）分析它們單獨或者聯(lián)合鑒別診斷ATB 和LTBI 的能力。

1 資料與方法

1.1 研究對象納入的ATB 患者為2018年2-7月期間解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心的住院患者，結核病的診斷依據(jù)為“肺結核診斷［8］”，包括臨床表現(xiàn)、CT 檢查、抗酸桿菌染色（AFB）、細菌培養(yǎng)和核酸檢測等。ATB共計91例，男57例，女34例，平均年齡為48 歲（21～65 歲）。LTBI 和健康對照（healthy control，HC）為2018年3-6月期間解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心的體檢人員，兩組受試者均沒有結核病史和結核病臨床表現(xiàn)，X 線檢查正常，IGRA 陽性者為LTBI，IGRA 陰性者為HC。LTBI 共計31 例，男19 例，女12 例，平均年齡為46 歲（28～59 歲）。HC 共計31 例，男18 例，女13 例，平均年齡為38 歲（23～56 歲）。三組受試者的年齡和性別組成差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。納入的研究對象均沒有肝炎、艾滋病和自身免疫相關疾病。本研究通過解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集與處理抽取受試者外周血置于肝素抗凝管中，4～6 h 內用Ficoll 分離液（美國GE）分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），用RPMI-1640 培養(yǎng)液（美國Invitrogen）洗滌細胞2 遍，細胞沉淀用1 mL 的Trizol（美國Invitrogen）溶解，然后凍于-80 ℃中備用。

1.2.2 RNA 提取和cDNA 合成按以前的操作步驟提取細胞總RNA［9］，按TaKaRa 反轉錄試劑盒（大連寶生物）操作說明合成cDNA。

1.2.3 引物序列及qPCR 檢測利用NCBI 網(wǎng)站Primerblast 進行引物設計，GATA2 的參照基因序列號為：NM_001145661，上游引物為“5'-CCTGGCGCACAACTACATGG-3'”，下游引物為“5'-ACATCTGGCCTCCGGTCA-3'”。PRDM1 的參照基因序列號為：NM_001198，上游引物為“5'-TTAAGCCCATCCCTGCCAAC-3'”，下游引物為“5'-GCTCGGTTGCTTTAGACTGC-3'”。選擇GAPDH為內參基因，參照的基因序列號為：NM_002046，上游引物為“5'-TGTTGCCATCAATGACCCCT-3'”，下游引物為“5'-TCGCCCCACTTGATTTTGGA-3'”。用SYBR GreenⅠ試劑盒（美國KAPA）進行qPCR 檢測，每個反應設2 個復孔。反應程序為：95 ℃3 min，1 個循環(huán)；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 個循環(huán)。另外設計溶解曲線程序進行引物特異性檢驗。PCR 反應在LightCycle?480Ⅱ（Roche）上進行。

1.3 統(tǒng)計學方法所有反應的Ct 值均為2 個復孔的平均值，PRDM1 或GATA2 基 因mRNA 的 表達=2-△Ct（PRDM1/GATA2-GAPDH），數(shù)值用（±s）表示。采用Graphpad 5.0 和SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。其中Mann-Whitney 或Kruskal-Wallis 用于2 組或3 組 數(shù)據(jù)的非參數(shù)檢驗，受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）用于線下面積（area under curve，AUC）、診斷靈敏度和特異度分析，取約登指數(shù)最大對應的cut-off 值計算診斷的靈敏度和特異度。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PRDM1 和GATA2 的mRNA 在不同受試者中的表達分析3 組受試者PRDM1 和GATA2 的mRNA表達差異，結果顯示ATB的PBMCs中PRDM1和GATA2 的mRNA 表達均顯著低于LTBI 和HC（H=69.27，P＜0.000 1；H=37.97，P＜0.000 1）。隨后按AFB 或細菌培養(yǎng)的結果將ATB 分為菌陽組和菌陰組，按結核發(fā)病部位將ATB分為肺結核和肺外結核，分析ATB 各組GATA2 和PRDM1 的mRNA 表達差異。統(tǒng)計學分析顯示，菌陽組和菌陰組ATB、肺結核和肺外結核ATB 中GATA2 的mRNA 表達差異無統(tǒng)計學意義（U=1 149，P=0.418；U=1 363，P=0.313 3）。ATB各組中PRDM1的mRNA 在菌陽組和菌陰組ATB、肺結核和肺外結核的表達也近似（U=881.5，P=0.314 4；U=1 263，P=0.567 8）。見圖1。

圖1 PRDM1 和GATA2 的mRNA 表達Fig.1 The mRNA expression of PRDM1 and GATA2 gene

2.2 PRDM1 和GATA2 的mRNA 對ATB 和LTBI的鑒別診斷以LTBI 為對照，用ROC 分析了PRDM1 和GATA2 的mRNA 診斷性能。GATA2 的AUC 為0.806（95%CI：0.717～0.896），診斷靈敏度為82.35%（95%CI：73.55%～89.19%）和特異度為70.97%（95%CI：51.96%～85.78%）。PRDM1的AUC為0.8967（95%CI：0.840～0.953），診斷靈敏度為80.22%（95%CI：70.55%～87.84%）和特異度為87.1%（95%CI：70.17%～96.37%）。GATA2和PRDM1聯(lián)合診斷的性能分析結果顯示GATA2-PRDM1 的AUC 為0.935（95%CI：0.894～0.976），診斷的靈敏度為76.9%（95%CI：66.68%～84.84%），特異度為100%（95%CI：86.27%～100%）。見圖2。

圖2 PRDM1 和GATA2 的mRNA 單獨和聯(lián)合診斷ATB 和LTBI 的ROCFig.2 The ROC analysis of mRNA of PRDM1 and GATA2 alone and together distinguishing ATB from LTBI

3 討論

本研究收集ATB、LTBI 和健康人三組受試者外周血，qPCR 檢測前期篩選出的差異表達基因PRDM1 和GATA2 的表達，并分析它們作為診斷標志物的價值。結果證實ATB 外周血中PRDM1和GATA2 基因mRNA 顯著低于LTBI 和健康人，PRDM1 和GATA2 聯(lián)合起來能較好的鑒別診斷ATB 和LTBI，靈敏度和特異度分別達到76.9%和100%。本研究之所以納入ATB、LTBI 和健康人三組受試者是因為它們分別代表了人類三種M.tb 感染狀態(tài)，即感染后發(fā)病、感染后不發(fā)病和未感染。

不同的感染狀態(tài)下，宿主抗M.tb 的免疫應答不同，表達的基因產物也不同，這是差異表達基因及其產物作為診斷標志物的理論基礎。研究者通過轉錄組測序發(fā)現(xiàn)ATB 和LTBI 中存在多個差異基因，并將其作為潛在的診斷標志物［10-12］。近年來研究人員不斷的尋找診斷效果更好的差異基因及其組合［13-23］。比如LAUX DA COSTA 等［13］發(fā)現(xiàn)GBP5、GZMA 和CD64 基 因組合能鑒別ATB 與LTBI，GLIDDON等［14］發(fā)現(xiàn)FCGR1A、ZNF296和C1QB基因組合能鑒別ATB 與LTBI。本研究發(fā)現(xiàn)，與基因組合相比，PRDM1 或GATA2 單一基因的診斷效能較低，PERUMAL 等［15］也證實GBP1 和IFIT3 單一的診斷效能低于雙基因組合。

ATB 為全身性疾病，相比于肺結核，肺外結核的診斷更困難［24-25］，本研究ATB 中納入了18 例肺外結核（約占納入ATB 病例的1/5），統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)肺結核和肺外結核中PRDM1 和GATA2 的平均表達水平相似，提示這兩個基因不僅可以用于肺結核的診斷也可以用于肺外結核的診斷。此外，菌陰結核病也是結核病診斷的難點，本研究按涂片鏡檢的結果將ATB 分為菌陰和菌陽兩組，結果表明兩組患者PRDM1 和GATA2 的表達水平沒有差異，提示PRDM1 和GATA2 也可以用于菌陰結核病的診斷。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)PRDM1 和GATA2 基因的mRNA 聯(lián)合起來可以用于ATB 和LTBI 的鑒別診斷。但是本研究收集的各組樣本數(shù)較少，PRDM1和GATA2 作為結核病診斷標志物的能力還需要在更大的樣本中進行驗證。此外PRDM1 和GATA2 聯(lián)合診斷的靈敏度還有待提高，是否需要聯(lián)合其他的基因（如CD64）還需要進一步的研究。