嘔吐毒素氧化酶的解毒效果研究

劉佳旭，韓倩，郭思桃，尤欣，凌雪，楊華杰，齊振雄，王永強*

（1.清遠海貝生物技術有限公司，廣東 清遠 511800；2.廣東海大集團股份有限公司農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生態(tài)資源養(yǎng)殖利用重點實驗室，廣州 511400）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是近年來逐步引起人們重視的一種霉菌毒素，其分布廣、危害普遍，特別是伴隨著谷物的生長過程而產(chǎn)生，不易預防，多分布于大麥、小麥、玉米等谷物籽實中[1]。近期，一項有關食品中DON含量的調(diào)查結(jié)果表明，在大多數(shù)受檢樣品中，DON的含量超標[2]。DON屬于單端孢霉烯族化合物，主要由某些鐮刀菌產(chǎn)生，因其能引起動物嘔吐，故又稱嘔吐毒素（Vomitoxin）。DON是全球最常見的單端孢霉烯類霉菌毒素，盡管其不能對畜禽造成急性毒性發(fā)作，但卻能導致動物生產(chǎn)性能下降，進而造成經(jīng)濟損失。DON可導致動物生產(chǎn)性能降低，采食量下降[3]，在所有家畜中，豬對DON最為敏感，當飼料中的DON含量超過0.9 mg·kg-1時，可導致豬產(chǎn)生厭食、營養(yǎng)吸收不良、體重下降及免疫系統(tǒng)變化等現(xiàn)象[4]。DON的靶器官為腸道內(nèi)皮細胞和免疫細胞，DON釋放自由基，導致體內(nèi)氧化還原反應失衡、脂質(zhì)過氧化、細胞完整性或功能的損傷[5]。此外，DON還具有很強的細胞毒性和胚胎毒性，已被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）確定為最危險的自然發(fā)生食品污染物之一[6]。目前，霉菌毒素的降解方法主要有三種，即物理吸附、生物降解和酶降解[7]。研究表明，DON的C12、C13位的環(huán)氧結(jié)構(gòu)和C3—OH基團是DON的主要致毒基團[8]。酶降解法主要是通過酶的作用破壞C12、C13位的環(huán)氧結(jié)構(gòu)及對C3位的乙?；?、糖基化和氧化[9]。本試驗以小鼠嘔吐毒素暴露動物模型為基礎，從免疫學、藥物代謝酶及機體氧化防御系統(tǒng)相關指標的變化來驗證嘔吐毒素氧化酶的應用效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

嘔吐毒素氧化酶（Vomitoxin oxidase，VO，由清遠某公司提供；禾谷鐮刀菌，由廣東海大集團農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生態(tài)資源養(yǎng)殖利用重點實驗室自行分離和保存，用于生產(chǎn)嘔吐毒素；環(huán)磷酰胺，購自阿拉丁公司；4%多聚甲醛，購自Biosharp公司；RNA提取試劑盒購自Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自TaKaRa公司；SYBR Green染料法Mix，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所有限公司；D-乳酸檢測試劑盒，購自索萊寶生物科技有限公司；嘔吐毒素ELISA檢測試劑盒，購自北京華安麥科生物技術有限公司。

PDA平板：稱取4.01 g PDA培養(yǎng)基粉末，加入100 mL去離子水，121℃、20 min高壓滅菌后冷卻至60℃左右倒入培養(yǎng)皿中，制成PDA平板。

CMC產(chǎn)孢培養(yǎng)基：羧甲基纖維素15 g，磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，硝酸銨1 g（或硫酸銨0.5 g代替），酵母提取物1 g。加去離子水定容到1 L，高壓滅菌，室溫保存。

TBI產(chǎn)毒培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，L-精氨酸0.871 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，微量元素混合液1 mL，蔗糖30 g。加去離子水至1 L，0.22 μm濾器過濾滅菌，室溫保存。

微量元素混合液：檸檬酸5 g，六水硫酸鋅5 g，二水鉬酸鈉50 mg，硫酸錳50 mg，五水硫酸銅250 mg，六水硫酸亞鐵銨1 g，硼酸50 mg。加去離子水至100 mL，0.22 μm濾器過濾滅菌，4°C保存。

1.2 試驗動物及分組

50只3周齡雄性昆明小鼠及鼠糧，均購自廣州南方醫(yī)大實驗動物科技發(fā)展有限公司。試驗小鼠隨機分為5組，腹腔注射環(huán)磷酰胺進行免疫抑制，將嘔吐毒素與粉碎的飼料混合均勻，隨后定型、烘干，制作成含嘔吐毒素的飼料。將液態(tài)嘔吐毒素氧化酶與嘔吐毒素飼料按照1∶1 000混合，自然風干后進行動物飼喂。第1組是嘔吐毒素暴露組；第2組是嘔吐毒素暴露后用嘔吐毒素氧化酶干預，即試驗組；第3組是環(huán)磷酰胺暴露組；第4組是環(huán)磷酰胺對照組；第5組是空白對照組。分組信息見表1。試驗周期為30 d，其中前5 d為小鼠環(huán)境適應期，后25 d為試驗期。室溫控制在26℃，晝夜明暗交替12 h/12 h，小鼠自由采食、飲水。

表1 嘔吐毒素暴露試驗小鼠分組情況

1.3 DON的生產(chǎn)

（1）取出凍存的禾谷鐮刀菌菌絲體，用接種環(huán)劃線在PDA平板中央，28℃靜置培養(yǎng)3~5 d，白色菌絲從中央向四周蔓延生長，平板逐漸變?yōu)榧t色，待菌絲長滿后重新劃線傳代培養(yǎng)；（2）挑取PDA平板最外面一圈白色菌絲，接入CMC產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，28℃、180 r·min-1培養(yǎng)4~7 d即可產(chǎn)生大量孢子；（3）將培養(yǎng)好的CMC產(chǎn)孢培養(yǎng)基按2%~5%比例接入產(chǎn)毒素TBI培養(yǎng)基中，28℃、180 r·min-1培養(yǎng)10~21 d，發(fā)酵液10 000 r·min-1室溫離心15 min取上清液，利用嘔吐毒素競爭ELISA試劑盒測定DON含量。

1.4 動物霉菌毒素暴露后相關指標的收集

1.4.1 體重

試驗期間每天上午記錄小鼠體重，并觀察其精神狀態(tài)。

1.4.2 炎癥相關細胞因子及肝臟、腸道代謝酶基因的檢測

收集所有試驗動物的肝臟和小腸，液氮凍存后按照試劑盒的說明書提取RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，利用熒光定量PCR方法檢測白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）和白介素-13（IL-13）、白介素-2（IL-2）、細胞色素P4503A11（CYP3A11）、細胞色素P4501A2（CYP1A2）、醛脫氫酶1家族成員A3（ALDH1A3）、含1的己糖激酶結(jié)構(gòu)域（HKDC1）、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶4（GSTA4）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的表達水平，引物見表2，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應體系為：Mix 5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，水3 μL；反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)，利用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析。

表2 qRT-PCR引物序列

1.4.3氧化酶防御系統(tǒng)相關指標的檢測

表2列出了學生對學習效果、工作量和組內(nèi)表現(xiàn)等各項的綜合回答情況。t檢驗表明,探究式實驗相對于傳統(tǒng)實驗提高了學習效果。此外,探究式實驗的占分比例可合理地反映工作量,小組能很好地進行實驗。對表1中問題Q3的回答表明,學生建議今后開展探究式實驗的平均次數(shù)為1.2(95%置信區(qū)間1.1～1.3),這意味著在其后的每個年級應開設至少一次探究式實驗。

使用南京建成生物工程研究所的SOD、GSH和MDA試劑盒，按照說明書進行小鼠肝臟和血清中相關指標的檢測。

1.4.4 腸道通透性的檢測

處死小鼠后，心臟采血2 mL，放入含有抗凝劑的采血管中，4℃保存，根據(jù)索萊寶D-乳酸檢測試劑盒的說明書進行血清中D-乳酸含量的檢測，用以評價小鼠腸道通透性情況。

1.5 統(tǒng)計與分析

將所得數(shù)據(jù)用軟件SPSS 21進行統(tǒng)計分析。首先利用Shapiro-Wilk對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗，隨后進行單因素方差分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重

試驗結(jié)束時各組小鼠精神狀態(tài)良好，體重測定結(jié)果見圖1。與第1組相比，第2組（試驗組）小鼠飼喂嘔吐毒素氧化酶后體重明顯增加（P＜0.05），恢復到對照組水平（P＞0.05）。

圖1 試驗小鼠體重

2.2 炎癥相關細胞因子表達水平

飼喂嘔吐毒素氧化酶后，肝臟中多種促炎和抑炎細胞因子表達水平下降，包括TNF-α、IL-6、IL-18、IL-10和IL-13（P＜0.05），見圖2。

圖2 炎癥相關細胞因子表達水平

2.3 肝臟和腸道代謝酶基因的表達情況

圖3 GSTA4、CYP3A11、CYP1A2在肝臟和腸道中的表達情況

飼喂嘔吐毒素氧化酶后，腸道中ALDH1A3表達水平明顯下降（P＜0.05），并明顯低于正常生長對照組（P＜0.05）；腸道中HKDC1的表達水平也表現(xiàn)出明顯下降（P＜0.05），恢復到正常生長對照組的水平，見圖4。

圖4 ALDH1A3和HKDC1在肝臟和腸道的表達情況

2.4 氧化防御系統(tǒng)及腸道通透性相關指標變化情況

各組動物肝臟中氧化防御相關指標及血液中D-乳酸的含量沒有明顯的差異，見圖5。

圖5 各組動物肝臟中氧化防御相關指標及血液中D-乳酸的含量

3 討 論

動物模型是人們研究疾病的重要方法之一，本研究初步建立了小鼠嘔吐毒素暴露動物模型。在本試驗中，與對照組相比，嘔吐毒素暴露的小鼠表現(xiàn)出體重下降及促炎細胞因子（TNF-α，IL-6，IL-18）的表達上調(diào)和抑炎細胞因子（IL-10和IL-18）的表達上調(diào)，說明了嘔吐毒素的效果得到體現(xiàn)，動物表現(xiàn)出炎癥反應。在飼喂嘔吐毒素氧化酶后，上述情況（體重下降、促炎細胞因子表達上調(diào)和抑炎細胞因子下調(diào)）得到明顯好轉(zhuǎn)，體重及炎癥相關細胞因子的表達水平與對照組差異不顯著（P＞0.05），說明小鼠體內(nèi)的炎癥反應得到緩解，并恢復了體重。

肝臟中代謝酶表達水平的試驗結(jié)果表明，與對照組相比，嘔吐毒素暴露后，小鼠表現(xiàn)出肝臟細胞色素P4503A11和P4501A2表達水平下調(diào)（P＜0.05）。肝臟中細胞色素P4503A11與P4501A2是重要的外源物質(zhì)代謝酶[5]（Ⅰ相肝藥酶），參與機體毒素代謝，嘔吐毒素進入動物機體后，降低其表達水平，進而降低肝臟代謝毒素的效率，這可能是嘔吐毒素造成機體損傷的原因之一。在飼喂嘔吐毒素氧化酶后，與對照組相比，肝臟細胞色素P4501A2的表達水平有所恢復，細胞色素P4503A11的表達水平恢復到正常水平（P＞0.05），體現(xiàn)出了嘔吐毒素氧化酶提高肝臟對霉菌毒素代謝的潛力。

腸道中代謝酶表達水平試驗結(jié)果表明，與對照組相比，嘔吐毒素暴露后，小鼠表現(xiàn)出腸道細胞色素P4501A2、ALDH1A3和HKDC1表達水平上調(diào)（P＜0.05）。腸道中細胞色素P4501A2和ALDH1A3均是Ⅰ相代謝酶，ALDH1A3是醛代謝最重要的酶系統(tǒng)[6]，嘔吐毒素進入機體后主要在小腸吸收，這兩種代謝酶的上調(diào)表達可能是機體加速霉菌毒素代謝的應答機制之一（機體減少嘔吐毒素在腸道逗留時間、加速其吸收進入血液），也可能是嘔吐毒素導致機體損傷的原因之一。在飼喂嘔吐毒素氧化酶后，與模型組相比，腸細胞色素P4501A2表達水平下調(diào)，恢復到對照組水平，且ALDH1A3的表達水平明顯低于對照組（P＜0.05），上述兩個基因表達水平的下調(diào)降低了腸道對毒素的吸收能力，緩解了通過肝腸循環(huán)導致的肝臟代謝毒素的壓力。HKDC1是一種新發(fā)現(xiàn)的己糖激酶，具有維持全身葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)的作用[7]，在肝臟中HKDC1的過表達會導致肝臟線粒體功能障礙[8]，根據(jù)文獻報道，下調(diào)腸道中HKDC1的表達可以緩解腸道炎癥反應[9]，因此，飼喂嘔吐毒素氧化酶后，與對照組相比，腸道中HKDC1表達水平下降，有助于腸道炎癥的緩解。因此，認為嘔吐毒素氧化酶可以從恢復肝臟對嘔吐毒素的代謝、減少嘔吐毒素在腸道的吸收效率、緩解腸道炎癥等幾個方面減少嘔吐毒素對機體的損傷[10-12]。

此外，在小鼠嘔吐毒素暴露動物模型建立的過程中，飼喂含有30 mg·kg-1和50 mg·kg-1DON的飼料36 d，各組小鼠均不會出現(xiàn)體重下降、炎癥相關細胞因子上調(diào)等現(xiàn)象，更不會表現(xiàn)出氧化防御系統(tǒng)相關指標的改變。50 mg·mL-1環(huán)磷酰胺腹腔注射小鼠后，直接飼喂3 mg·kg-1DON即可達到本試驗的結(jié)果，但氧化防御系統(tǒng)相關指標也不會發(fā)生明顯的變化，這是值得進一步關注的一個現(xiàn)象，只有在免疫抑制的條件下，嘔吐毒素才會對機體造成較為明顯的影響。在今后的研究中，將會通過加大嘔吐毒素的飼喂劑量、增加飼喂時間、進一步降低毒素在體內(nèi)的代謝時間等方法優(yōu)化該模型，為進一步篩選嘔吐毒素的降解方法奠定基礎。

4 結(jié) 論

（1）飼料中添加嘔吐毒素會使動物表現(xiàn)出炎癥反應，嘔吐毒素氧化酶可以緩解炎癥反應、恢復體重。

（2）嘔吐毒素氧化酶具有提高肝臟對霉菌毒素代謝的潛力。

（3）嘔吐毒素氧化酶可以通過恢復肝臟對嘔吐毒素的代謝、減少嘔吐毒素在腸道的吸收效率、緩解腸道炎癥等幾個方面來減少嘔吐毒素對機體的損傷。