超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定柴胡中4種成分的含量

郭宇鴿，柏玉冰，李洪權(quán)，胡冠羽，黎旭*（.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 40007；.長沙市第三醫(yī)院，長沙 4005；.株洲市食品藥品檢驗所，湖南 株洲 4000）

柴胡是傘形科（Apiaceae）植物北柴胡（Bupleurum chinenseDC.）的干燥根。其性味辛、苦，微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，具有疏散退熱，疏肝升陽，升舉陽氣等功效[1]。柴胡主要含有皂苷[2]、揮發(fā)油[3]、黃酮[4]、多糖[5]、香豆素、多炔[6]等成分，具有解熱、調(diào)節(jié)免疫[7]、抗抑郁[8]、保肝[9]、抗腫瘤[10]、抗炎[11]等作用。

目前，柴胡所有藥理作用中，研究最典型的是解熱作用。有研究認為，其作用成分主要為直接產(chǎn)生解熱作用的柴胡皂苷和揮發(fā)油以及通過抑制熱源而間接產(chǎn)生解熱作用的黃酮[12-13]。也有研究者認為，柴胡的傳統(tǒng)用藥方式為煎煮，此時，揮發(fā)油含量不足以達到解熱效果[14]，因此，柴胡發(fā)揮解熱作用的成分應該以柴胡皂苷和黃酮為主。而柴胡中各種柴胡皂苷和黃酮含量有差異，含量較高者為柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、蘆丁以及槲皮素[15-17]。目前，關于同時測定含這4種成分含量的方法，只有液相色譜法[18]。而相對液相色譜法，具有信號采集時間短，選擇性強等優(yōu)勢[19]的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法尚未見報道。

本文基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）法建立柴胡中4種成分的含量測定方法，以期更好地控制其質(zhì)量。

1 材料

1.1 試藥

柴胡樣品源自于藥店、網(wǎng)商和藥材市場，信息見表1。所有批次藥材經(jīng)株洲市食品藥品檢驗所胡冠羽主管藥師鑒定均為傘形科（Apiaceae）植物北柴胡（Bupleurum chinenseDC.）的段根。柴胡皂苷a（批號：110777-201711，純度：98.0%）、柴胡皂苷d（批號：110778-201711，純度：98.0%）、槲皮素（批號：100081-200907，純度：97.4%）和蘆?。ㄅ枺?0080-200707，純度：90.5%）對照品（中國食品藥品檢定研究院）。

表1 樣品信息Tab 1 Sample information

甲酸、乙酸銨（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，霍尼韋爾有限公司）。

1.2 儀器

XSE 205DV型電子天平（精度：0.01 mg，梅特勒托利多儀器有限公司）；HNS-SY-150型超聲波儀（北京恒奧德儀器儀表有限公司）；Agilent 1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；QTRAP 4500型三重四極桿質(zhì)譜（上海愛博才思分析儀器有限公司）等。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 采用Welch Utimate AQ-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，以水（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫（0～5 min，90%→55%A；5～10 min，55%→30%A；10～12 min，30%→10%A；12～12.5 min，10%→90%A；12.5～15 min，90%A），流速0.5 mL·min－1，采集時間15 min，柱溫30℃，進樣量5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜：電噴霧電離源（ESI），負離子掃描，多反應監(jiān)測（MRM），離子源溫度：550℃，電噴霧電壓：－4500 V，氣簾氣：35.0 psi，離子源氣1：55 psi，離子源氣2：55 psi，碰撞氣：氬氣。各成分的質(zhì)譜參數(shù)見表2，準分子離子見圖1。

圖1 4種成分的準分子離子圖Fig 1 Excimer ion of 4 components

表2 4種成分的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)Tab 2 Retention time and UPLC-MS/MS parameters of the 4 components

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品儲備液 精密稱取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁對照品適量，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。經(jīng)含量折算后，上述各對照品的質(zhì)量濃度分別為1.0094、1.0388、0.983 74、0.977 40 mg·mL－1。對照品提取離子色譜圖見圖2A。

2.2.2 供試品溶液 取柴胡粉末（粉碎后過4號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇30 mL，稱量，超聲（400 W，40 kHz）提取30 min，靜置至室溫，再稱量，用70%甲醇補足減失的量，搖勻，精密量取1 mL搖勻后的溶液，置于10 mL量瓶中，加入70%甲醇定容至刻度線，再次搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，注入質(zhì)譜儀進行分析。柴胡樣品提取離子色譜圖見圖2B。

圖2 柴胡混合對照品和樣品中分析物提取離子色譜圖Fig 2 Extracted ion chromatogram of Bupleurum chinense DC.mixture reference and sample

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密量取混合對照品儲備液適量，用70%甲醇稀釋得系列混合對照品溶 液（柴胡皂苷a：100.940、504.700、1009.40、2018.80、4037.60、5047.00 ng·mL－1；柴胡皂苷d：103.880、519.400、1038.80、2077.60、4155.20、5194.00 ng·mL－1；槲 皮 素：4.918 70、24.5935、49.1870、98.3740、196.748、245.935 ng·mL－1；蘆丁：122.175、610.875、122 1.75、244 3.50、488 7.00、610 8.75 ng·mL－1），進樣測定，以質(zhì)量濃度X（ng·mL－1）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，計算4種成分的線性回歸方程，結(jié)果見表3，4種成分在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

表3 線性關系結(jié)果(n＝6)Tab 3 Linear regression (n＝6)

2.3.2 精密度試驗 取混合對照品溶液，按照“2.1”項下條件連續(xù)進樣6次，記錄各成分峰面積并計算RSD。結(jié)果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁峰面積的RSD分別為0.96%、0.79%、1.1%和1.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批樣品（批號：CH20210314-1）6份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄各成分峰面積并計算RSD。結(jié)果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁峰面積的RSD分別為1.3%、1.3%、1.4%和1.2%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批樣品供試品溶液（批號：CH20210314-1），分別于0、2、4、8和12 h進樣分析，記錄各成分峰面積并計算RSD。結(jié)果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁峰面積的RSD分別為1.7%、2.0%、1.5%和1.7%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收試驗 取已知含量的樣品（批號：CH20210314-1）6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入絕對含量接近0.25 g藥材所含量的對照品溶液后，按“2.2.2”項下方法制備，進樣分析，計算加樣回收率，結(jié)果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁的平均加樣回收率為98.74%、97.96%、97.97%和98.41%，RSD均小于1.5%，表明本方法回收率良好。

2.4 樣品測定

精密稱取6批次不同批號的柴胡各2份，分別按照“2.2.2”項下方法制備，按照“2.1”項下條件進樣測定，代入線性回歸方程，計算4種成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 6批次樣品的4種成分的含量(μg·g－1，n＝2)Tab 4 Contents of 4 components in 6 batches of samples(μg·g－1，n＝2)

3 討論

3.1 供試品溶液制備條件優(yōu)化

本研究比較了不同提取溶劑（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和90%甲醇），不同提取體積（20、30、40和50 mL），不同提取時間（10、20、30和40 min）對供試品溶液制備的影響，以4種成分的峰面積大小為判斷依據(jù)，確定最佳條件。結(jié)果，當甲醇濃度為70%，提取體積為30 mL，提取時間為30 min時，各成分峰面積均為最大值，因此選為最佳制備條件。

3.2 色譜條件優(yōu)化

本研究比較了4種流動相組成（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-含5 mmol·L－1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液），4種C18色 譜 柱（Agilent Eclipse XDB、Thermo Acclaim 120、Welch Xtimate和Welch Utimate AQ，規(guī)格：4.6 mm×150 mm，5 μm），2種洗脫程序[乙腈-水（40∶60）等度洗脫和梯度洗脫（詳見本文色譜條件）]，3種流速（0.3、0.5和0.7 mL·min－1）。結(jié)果，流動相組成為甲醇-水溶液時，各成分的峰稍有拖尾現(xiàn)象，水相加入乙酸銨各成峰面積被抑制；加入乙腈-水，拖尾得到改善，峰寬較窄；加入甲酸，無明顯變化，因此，乙腈-水為最佳流動相組成。4種色譜柱均得到良好的峰形和分離度，但是Welch Utimate AQ柱相對其他色譜柱，各成分峰寬更窄，峰形更為尖銳，保留性更好，因此選為最合適色譜柱。洗脫程序中，等度洗脫時各成分峰形均有拖尾，換成梯度洗脫，峰形得到改善，因此選為最佳洗脫程序。流速為0.3和0.5 mL·min－1時，各成分峰形、峰面積相當；但是當流速為0.3 mL·min－1時出峰慢，不利于提高分析效率；當流速為0.7 mL·min－1時，各成分離子化不充分，峰面積變小，因此，選擇0.5 mL·min－1為最佳流速。

3.3 質(zhì)譜參數(shù)的建立

通過比較正、負離子模式下各成分分子離子峰信號強度，選擇負離子模式；根據(jù)信號強度曲線，選擇各成分分子離子峰信號最強時所顯示數(shù)值；離子源溫度、電噴霧電壓、氣簾氣及離子源氣等參數(shù)則選擇儀器默認參數(shù)。

3.4 方法優(yōu)劣比較

目前對柴胡中皂苷和黃酮成分進行定量分析的方法有多種，如HPLC-DAD（二極管陣列檢測器）、HPLC-ELSD（蒸發(fā)光散射檢測器）等。相對而言，本法優(yōu)勢明顯，主要體現(xiàn)在快速、選擇性強等方面。如郭司群等[20]測定柴胡皂苷d的時長達到60 min，韋英杰等[18]同時測定柴胡中皂苷和黃酮成分的時長更是達到70 min，而本法只需15 min。另外，李衛(wèi)斌等[21]測定柴胡皂苷含量時，柴胡皂苷c與雜峰分離不徹底，有部分重疊。韋杰英等[18]采用的方法中，柴胡皂苷a峰也與雜峰有重疊，影響到皂苷成分定性定量的準確性，而本法除色譜柱的分離功能，還可根據(jù)分析物的不同質(zhì)荷比具有二次分離功能，專屬性強，干擾少。但是，本法設備比較昂貴，可能在前期投入和方法推廣方面不如上述方法。

3.5 總結(jié)

本研究建立了柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁4種成分的超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜含量測定方法，為基于這4種成分對柴胡進行解熱的量效關系評價提供了研究基礎。