金銀花化學成分及抗菌消炎活性研究

肖蕾，包正雪，郁陽，黃金蓮，吳靜，蔡百祥*（.無限極（中國）有限公司，廣州 506；.云南大學生物資源保護與利用國家重點實驗室，昆明 6500；.中國科學院昆明植物研究所 植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，昆明 6500）

金銀花來源于忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，是一味常用的治療多種疾病的中藥?！吨袊幍洹?020年版一部中描述其具有清熱解毒、疏散風熱的功效[1]。目前，關于金銀花的化學成分報道主要集中在環(huán)烯醚萜苷類、三萜皂苷類和有機酚酸類等，現(xiàn)代藥理學研究表明金銀花中的化學成分具有多種生物活性，包括抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化，增強機體免疫功能等[2-4]。為了進一步闡明中藥金銀花抗菌消炎的藥效物質基礎，本文對金銀花70%乙醇提取物進行化學成分研究，共分離并鑒定了22個化合物，分別為斷氧馬錢子苷（1）、secologanol（2）、金吉苷（3）、8-表金吉苷（4）、獐牙菜苷（5）、7-酮馬錢素（6）、斷氧馬錢子苷半縮醛內酯（7）、表斷氧馬錢子苷半縮醛內酯（8）、threoninosecologanin（9）、5S-羧基異胡豆苷（10）、坎卡酯苷（11）、1，2-O-二咖啡酰基-3-羥基-環(huán)戊醇（12）、4，5-O-二咖啡?；鼘幩幔?3）、咖啡酸（14）、綠原酸（15）、紫丁香苷（16）、蘆?。?7）、supinaionodie B（18）、cordysinin B（19）、鳥嘌呤核苷（20）、腺嘌呤核苷（21）、煙酰胺（22），其中化合物11、12、18、22為首次從金銀花藥材中分離得到。通過抗菌消炎活性實驗發(fā)現(xiàn)，化合物2、5、11、19對厭氧菌變異鏈球菌顯示出一定的抑制作用，化合物4、6、8、15對金黃色葡萄球菌顯示出一定的抑制作用。

1 材料

Bruker AV-400型、DRX-500型和AVANCEⅢ-600型核磁共振譜儀（Bruker公司）；Shimadzu UPLC-IT-TOF質 譜 儀（Shimadzu公 司）；Buchi中壓制備色譜（RP-C18，15 mm×230 mm或26 mm×460 mm）；Waters1525型高效液相制備色譜儀（Waters公司）。柱層析硅膠200～300目（青島海洋化工廠）；薄層硅膠板（GF254，青島海洋化學試劑廠）；ODS（40～60 μm，美國Sepax公司）；Waters xbridge C18色譜柱（19 mm×250 mm，Waters公司）；硫酸-乙醇溶液顯色（實驗室自制）；其他試劑均為分析純（國藥集團上?；瘜W試劑公司）。小鼠單核巨噬細胞RAW264.7（中科院上海細胞庫），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（BI公司）；Griess 試劑、脂多糖（LPS）、甲基鹽酸精氨酸（L-NMMA）（Sigma公司）；環(huán)氧化酶（COX）試劑盒（Cayman，美國）；大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌金黃亞種ATCC29213、腸沙門氏菌腸亞種ATCC14028、銅綠假單胞菌ATCC27853（中國普通微生物菌種保藏管理中心）；白假絲酵母菌ATCC10231（美國Microbiologics公司）；牙齦卟啉單胞菌（Pg）、具核梭桿菌具核亞種（Fn）、變異鏈球菌（Sm）（廣州速研生物有限公司）；Spark 10M多功能酶標儀（瑞士TECAN公司）。

阿司匹林、帕瑞昔布、氨芐西林（上海源葉生物科技有限公司），青霉素G鈉（Biosharp公司），金銀花藥材[無限極（中國）有限公司，經中國科學院昆明植物研究所蔡祥海研究員鑒定為忍冬科忍冬屬金銀花Lonicerae japonicae flos的干燥花蕾]。鑒定標本存于中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部資源持續(xù)利用國家重點實驗室。

2 提取與分離方法

金銀花藥材2 kg粉碎，以10倍量體積的70%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，濃縮回收乙醇至無醇味，用適量的蒸餾水混懸，再用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取部分（約100 g）和水層（約2 kg）。水層采用大孔吸附樹脂以不同濃度的乙醇-水溶液進行洗脫（0%～95%乙醇），洗脫得到純水，20%、40%、60%、80%、95%乙醇水洗脫部位。利用HPLC來檢測不同濃度乙醇的洗脫部位，20%乙醇洗脫部位在乙腈水系統(tǒng)條件下的色譜峰較多，因此對20%乙醇洗脫部位進行化學分離，20%乙醇洗脫部位采用硅膠色譜柱分離，以三氯甲烷-甲醇（50∶1～0∶1，V/V）為流動相梯度洗脫，得到6個流分部位Fr.1～Fr.6。Fr.1（約2 g）經ODS中壓制備色譜（10%～45%甲醇-水溶液）洗脫分離并經過制備液相純化（10%～15%乙腈-0.01%甲酸水，流速 10 mL·min－1）得到化合物1（2.4 mg）、2（5.8 mg）、20（10 mg）、21（8 mg）。Fr.2（約3 g）經反復中壓制備色譜（10%～40%甲醇-水溶液）洗脫分離并經過制備液相純化（10%～20%乙腈-0.01%甲酸水，流速 10 mL·min－1）得到化合物1（16 mg）、3（22 mg）、4（9 mg）、5（12 mg）、6（10 mg）、7（33 mg）。Fr.3（約5 g）經中壓制備色譜（5%～40%甲醇-水溶液）洗脫分離得到亞組分Fr.3-1至Fr.3-6，F(xiàn)r.3-2再經過制備液相純化（10%～20%乙腈-0.01%甲酸水，流速 10 mL·min－1）得到化合物8（16 mg），9（23 mg），10（12 mg），22（5 mg）。Fr.4（約5 g）經過中壓制備色譜（5%～40%甲醇-水溶液）洗脫并經制備液相純化（8%～19%乙腈-0.01%甲酸水，流速 10 mL·min－1）得到化合物11（20 mg），12（13 mg），15（22 mg），16（10 mg）。Fr.5（約8 g）經過中壓制備色譜（5%～45%甲醇-水溶液）洗脫得到亞組分Fr.5-1至Fr.5-6，洗脫組分Fr.5-2經制備液相純化（9%～22%乙腈-0.01%甲酸水，流速 10 mL·min－1）得到化合物13（33 mg），14（20 mg）。Fr.6（約4 g）經中壓制備色譜（10%～55%甲醇-水溶液）以及凝膠柱色譜（甲醇洗脫）再經制備液相純化（10%～25%乙腈-0.01%甲酸水，流速 10 mL·min－1）得到化合物17（5 mg），18（12 mg），19（8 mg）。

3 結構解析

化合物1：淡黃色油狀物；分子式為C17H24O11；ESI＋-MSm/z：427 [M＋Na]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.44（1H，brs，H-3），5.63（1H，m，H-8），5.47（1H，d，J＝3.7 Hz，H-1），5.25（1H，d，J＝17.0 Hz，H-10a），5.21（1H，d，J＝10.3 Hz，H-10b），4.64（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1'），3.87（1H，dd，J＝11.7，1.4 Hz，H-6'b），3.66（3H，s，11-OCH3），3.65（1H，d，J＝12.2，5.6 Hz，H-10b），3.33（1H，overlapped，H-3'），3.32（1H，overlapped，H-5'），3.29（1H，overlapped，H-5），3.26（1H，t，J＝8.4 Hz，H-4'），3.19（1H，dd，J＝16.5，4.5 Hz，H-2'），2.91（1H，dd，J＝16.5，4.6 Hz，H-6a），2.81（1H，m，H-9），2.91（1H，dd，J＝16.5，9.1 Hz，H-6b）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：177.3（C-7），168.9（C-11），153.3（C-3），134.6（C-8），120.4（C-10），110.4（C-4），99.8（C-1'），97.7（C-1），78.4（C-5'），77.9（C-3'），74.6（C-2'），71.5（C-4'），62.7（C-6'），51.7（11-OCH3），45.3（C-9），35.8（C-6），28.7（C-5）?；衔?的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[5]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為斷氧馬錢子苷。

化合物2：淡黃色油狀物；分子式為C17H26O10；ESI＋-MSm/z：413 [M＋Na]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.44（1H，s，H-3），5.63（1H，m，H-8），5.47（1H，d，J＝3.6 Hz，H-1），5.25（1H，d，J＝10.0 Hz，H-10a），5.30（1H，d，J＝17.5 Hz，H-10b），4.69（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1'），3.89（1H，d，J＝11.6 Hz，H-6'b），3.70（3H，s，11-OCH3），3.61（1H，overlapped，H-6'a），3.55（2H，s，H-7），3.38（1H，overlapped，H-3'），3.31（1H，m，H-5'），3.20（1H，t，J＝8.2 Hz，H-4'），2.91（1H，dd，J＝4.5，16.2 Hz，H-2'），2.81（1H，m，H-5），2.21（2H，dd，J＝9.3，16.2 Hz，H-6）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：169.4（C-11），153.5（C-3），135.8（C-8），119.3（C-10），111.6（C-4），100.0（C-1'），97.7（C-1），78.4（C-5'），77.9（C-3'），74.6（C-2'），71.5（C-4'），62.7（C-6'），61.1（C-7），51.7（11-OCH3），45.3（C-9），33.6（C-6），30.7（C-5）?；衔?的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[6]報道基本一致，故鑒定該化合物為secologanol。

化合物3：淡黃色油狀物；分子式為C17H24O11；ESI＋-MSm/z：427 [M＋Na]＋；1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.45（1H，s，H-3），5.66（1H，d，J＝6.0 Hz，H-1），4.76（1H，dd，J＝4.3，6.8 Hz，H-8），4.68（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1'），3.88（1H，dd，J＝1.5，11.8 Hz，H-6'a），3.71（3H，s，11-OCH3），3.64（1H，dd，J＝5.6，12.0 Hz，H-6'b），3.35（1H，t，J＝8.6 Hz，H-3'），3.26（1H，d，J＝9.6 Hz，H-5'），3.23（1H，overlapped，H-5），3.18（1H，d，J＝9.0 Hz，H-4'），3.00（1H，dd，J＝9.0，8.0 Hz，H-2'），2.84（1H，dd，J＝7.5，17.0 Hz，H-6a），2.62（1H，dd，J＝17.0，6.0 Hz，H-6b），2.42（1H，dd，J＝6.0，4.5 Hz，H-9），1.51（3H，d，J＝6.8 Hz，H-10）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：174.3（C-7），168.1（C-11），154.3（C-3），111.3（C-4），100.0（C-1'），94.2（C-1），78.4（C-5'），77.9（C-3'），76.6（C-8），74.7（C-2'），71.6（C-4'），62.8（C-6'），51.8（OCH3），39.8（C-9），34.2（C-6），27.9（C-5），18.3（C-10）?；衔?的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[7]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為金吉苷。

化合物4：黃色油狀物；分子式為C17H24O11；ESI＋-MSm/z：427 [M＋Na]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.58（1H，s，H-3），5.49（1H，d，J＝7.7 Hz，H-1），4.70（1H，d，J＝7.9 Hz，H-1'），4.49（1H，m，H-8），3.91（1H，d，J＝1.5，11.9 Hz，H-6'b），3.72（3H，s，11-OCH3），3.62（1H，d，J＝6.7，11.9 Hz，H-6'a），3.40～3.30（3H，overlapped，H-3'～5'），3.07（1H，m，H-5），2.86（1H，dd，J＝4.5，16.4 Hz，H-6a），2.50（1H，dd，J＝11.4，16.4 Hz，H-6b），2.13（1H，m，H-9），1.50（3H，d，J＝6.3 Hz，H-10）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：174.7（C-7），168.3（C-11），154.4（C-3），109.5（C-4），100.6（C-1'），96.2（C-1），78.5（C-5'），77.8（C-3'），75.7（C-2'），74.6（C-8），71.6（C-4'），62.8（C-6'），52.0（11-OCH3），41.8（C-9），34.6（C-6），28.2（C-5），21.7（C-10）?；衔?的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[8]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為8-表金吉苷。

化合物5：淡黃色油狀物；分子式為C16H22O9；ESI＋-MSm/z：408 [M＋Na]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.59（1H，d，J＝2.1 Hz，H-3），5.56（1H，overlapped，H-8），5.53（1H，overlapped，H-1），5.33（1H，m，H-10a），5.27（1H，m，H-10b），4.68（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1'），4.45（1H，m，H-7b），4.36（1H，m，H-7a），3.89（1H，dd，J＝1.4，11.8 Hz，H-6'a），3.66（1H，dd，J＝5.5，11.8 Hz，H-6'b），3.39（1H，m，H-5），3.35（1H，overlapped，H-3'），3.31（1H，m，H-5'），3.22（1H，overlapped，H-4'），3.18（1H，overlapped，H-2'），2.70（1H，dd，J＝5.6，8.6 Hz，H-9），1.80（1H，m，H-6b），1.70（1H，m，H-6a）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：168.5（C-11），153.9（C-3），133.3（C-8），120.8（C-10），106.0（C-4），99.6（C-1'），97.9（C-1），78.3（C-3'），77.8（C-5'），74.6（C-2'），71.4（C-4'），69.7（C-7），62.6（C-6'），43.7（C-9），28.4（C-5），25.9（C-6）?；衔?的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[9]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為獐牙菜苷。

化合物6：白色粉末狀物質；分子式為C17H24O10；ESI＋-MSm/z：411 [M＋Na]＋；1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.48（1H，s，H-3），5.63（1H，d，J＝3.0 Hz，H-1），4.67（1H，d，J＝7.9 Hz，H-1'），3.90（1H，dd，J＝1.7，11.8 Hz，H-6'a），3.69（3H，s，11-OCH3），3.65（1H，dd，J＝6.0，11.8 Hz，H-6'b），3.27～3.09（3H，m，H-3'～5'），3.27～3.09（1H，m，H-5），2.63（1H，dd，J＝8.2，19.1 Hz，H-6b），2.51（1H，dd，J＝1.7，19.1 Hz，H-6a），2.35（1H，m，H-9），2.11（1H，m，H-8），1.06（3H，d，J＝6.8 Hz，10-CH3）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：220.7（C-7），168.8（C-11），153.2（C-3），111.0（C-4），100.1（C-1'），95.2（C-1），78.4（C-5'），77.9（C-3'），74.6（C-2'），71.5（C-4'），62.7（C-6'），51.8（11-OCH3），46.5（C-9），44.6（C-8），43.4（C-6），28.2（C-5），13.6（C-10）?；衔?的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[10]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為7-酮馬錢素。

化合物7：淡黃色油狀物；分子式為C17H24O10；ESI＋-MSm/z：411 [M＋Na]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OH）δ：7.58（1H，d，J＝2.4 Hz，H-3），5.55（1H，d，J＝1.2 Hz，H-1），5.47（1H，m，H-8），5.31（1H，s，H-7），5.29（1H，m，H-10a），5.26（1H，m，H-10b），4.66（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1'），3.54（1H，s，7-OCH3），3.16（1H，m，H-5），2.67（1H，m，H-9），1.97（1H，m，H-6a），1.44（1H，m，H-6b）；13C-NMR（125 MHz，CD3OH）δ：167.7（C-11），154.1（C-3），133.0（C-8），121.1（C-10），105.4（C-7），105.1（C-4），99.6（C-1'），97.8（C-1），78.3（C-5'），77.8（C-3'），74.6（C-2'），71.5（C-4'），62.6（C-6'），57.1（OMe-7），43.7（C-9），31.6（C-6），25.2（C-5）?；衔?的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[11]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為斷氧馬錢子苷半縮醛內酯。

化合物8：淡黃色油狀物；分子式為C17H24O10；ESI＋-MSm/z：411 [M＋Na]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OH）δ：7.62（1H，d，J＝2.0 Hz，H-3），5.55（1H，d，J＝1.8 Hz，H-1），5.48（1H，m，H-8），5.31（1H，s，H-7），5.29（1H，m，H-10a），5.25（1H，m，H-10b），4.68（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1'），3.51（3H，s，OMe-7），3.18（1H，m，H-5），2.63（1H，m，H-9），1.85（1H，dd，J＝6.0，13.2 Hz，H-6a），1.69（1H，td，J＝3.0，13.8 Hz，H-6b）；13C-NMR（125 MHz，CD3OH）δ：167.5（C-11），154.5（C-3），133.3（C-8），121.0（C-10），105.3（C-4），103.3（C-7），100.2（C-1'），98.4（C-1），78.3（C-5'），77.8（C-3'），74.6（C-2'），71.4（C-4'），62.6（C-6'），56.9（OMe-7），43.5（C-9），30.2（C-6），22.8（C-5）?；衔?的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[12]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為表斷氧馬錢子苷半縮醛內酯。

化合物9：淡黃色油狀物；分子式為C20H27NO11；ESI＋-MSm/z：480 [M＋Na]＋，1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.39（1H，d，J＝2.1 Hz，H-3），5.51（1H，overlapped，H-1），5.52（1H，overlapped，H-8），5.31（1H，dd，J＝17.0，1.5 Hz，H-10a），5.25（1H，dd，J＝10.2，1.5 Hz，H-10b），5.09（1H，dd，J＝9.6，3.7 Hz，H-7），4.66（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1'），4.13（1H，m，H-3''），4.04（1H，d，J＝7.8 Hz，H-2''），3.88（1H，dd，J＝11.7，1.7 Hz，H-6'a），3.66（1H，dd，J＝11.7，5.6 Hz，H-6'b），3.36（1H，overlapped，H-5'），3.34（1H，overlapped，H-4'），3.27（1H，overlapped，H-2'），3.18（1H，dd，J＝8.9，7.9 Hz，H-3'），3.12（1H，m，H-5），2.70（1H，m，H-6b），2.17（1H，overlapped，H-9），2.15（1H，s，H-4''），1.48（3H，d，J＝5.9 Hz，3''-CH3），1.31（1H，m，H-6a）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：173.3（C-1''），164.3（C-11），149.2（C-3），133.6（C-8），120.8（C-10），108.1（C-4），99.7（C-1'），97.4（C-1），88.6（C-7），78.5（C-3''），78.3（C-3'），77.8（C-5'），74.7（C-2'），71.5（C-4'），64.9（C-2''），62.6（C-6'），44.6（C-9），31.8（C-6），25.3（C-5），19.2（C-4''）?；衔?的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[13]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物9為threoninosecologanin。

化合物10：淡黃色粉末狀物質；分子式為C28H34N2O11；ESI＋-MSm/z：597 [M＋Na]＋，1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.82（1H，s，H-17），7.45（1H，d，J＝7.8 Hz，H-9），7.29（1H，d，J＝8.0 Hz，H-12），7.12（1H，t，J＝7.3 Hz，H-11），7.04（1H，t，J＝7.5 Hz，H-10），5.91（1H，d，J＝9.0 Hz，H-19），5.81（1H，m，H-21），5.37（1H，d，J＝17.3 Hz，H-18b），5.25（1H，d，J＝10.5 Hz，H-18a），4.81（1H，d，J＝7.9 Hz，H-1'），4.66（1H，d，J＝11.7 Hz，H-3），4.01（1H，m，H-6'b），3.93（1H，dd，J＝4.8，11.9 Hz，H-6'a），3.79（3H，s，-OCH3），3.67（1H，dd，J＝7.1，11.6 Hz，H-5），3.43～3.22（4H，m，H-2'～5'），3.08（1H，m，H-6），3.05（1H，m，H-15），2.76（2H，m，H-6a，H-20），2.22（1H，m，H-14a），2.43（1H，m，H-14b）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：173.4（C-23），171.8（C-22），157.2（C-17），138.5（C-13），135.2（C-19），130.3（C-2），127.5（C-8），123.4（C-11），120.6（C-10），119.7（C-18），119.1（C-9），112.2（C-12），108.6（C-16），108.3（C-7），100.4（C-1'），97.3（C-21），78.8（C-5'），77.9（C-3'），74.6（C-2'），71.7（C-4'），63.1（C-6'），53.0（C-5），52.8（-OCH3），49.5（C-3），45.3（C-20），34.6（C-14），32.7（C-15），24.0（C-6）?；?合 物10的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[14]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為5S-羧基異胡豆苷。

化合物11：淡黃色粉末狀物質；分子式為C22H36O11；ESI＋-MSm/z：499 [M＋Na]＋，975 [2M＋Na]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.84（1H，t，J＝7.4 Hz，H-3），5.10（1H，dd，J＝8.0，9.6 Hz，H-2''），4.42（1H，d，J＝7.9 Hz，H-1''），4.28（1H，d，J＝9.2 Hz，H-6'b），4.12（1H，d，J＝7.6 Hz，H-1'），3.91（1H，dd，J＝1.6，12.7 Hz，H-5''b），3.84（1H，brs，H-4''），3.74（1H，dd，J＝3.4，9.8 Hz，H-3''），3.61（2H，overlapped，H-8），3.37（1H，overlapped，H-5'），2.21（1H，m，H-4a），3.34（1H，overlapped，H-6'a），3.30（1H，overlapped，H-3'），3.11（1H，dd，J＝8.0，9.0 Hz，H-2'），3.01（1H，t，J＝9.0 Hz，H-4'），2.35（1H，m，H-4b），2.20（1H，m，H-5''a），1.85（3H，s，H-9），1.54（2H，m，H-5），1.58（1H，m，H-6），1.47（2H，m，H-7），0.99（3H，d，J＝6.4 Hz，H-10）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：169.1（C-1），144.4（C-3），128.6（C-2），103.4（C-1''），103.4（C-1'），78.0（C-3'），76.8（C-5'），75.1（C-2'），73.8（C-2''），72.7（C-3''），72.3（C-4'），70.9（C-6'），70.5（C-4''），70.1（C-8），67.8（C-5''），36.2（C-5），35.9（C-7），30.9（C-6），26.1（C-4），22.7（C-10），12.7（C-9）。化合物11的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[15]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為坎卡酯苷。

化合物12：白色粉末狀物質；分子式為C23H22O9；ESI＋-MSm/z：465 [M＋Na]＋，1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.60（d，1H，J＝16.0 Hz，H-7'），7.50（d，1H，J＝16.0 Hz，H-7''），7.01（d，1H，J＝2.0 Hz，H-2'），6.98（d，1H，J＝2.0 Hz，H-2'，2''），6.90（dd，2H，J＝2.0，8.0 Hz，H-6'，6''），6.75（d，1H，J＝8.0 Hz，H-5'），6.72（d，1H，J＝8.0 Hz，H-5''），6.27（d，1H，J＝16.0 Hz，H-8'），6.18（d，1H，J＝16.0 Hz，H-8''），5.62（m，1H，H-1），5.10（dd，1H，J＝2.4，9.2 Hz，H-2），4.37（m，1H，H-3），2.30（m，2H，H-4），2.20（m，1H，H-5a），2.12（m，1H，H-5b）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：168.5（C-9'），168.2（C-9''），149.6（C-4'，4''），147.6（C-7''），147.5（C-7'），146.7（C-3''），146.7（C-3'），127.6（C-1''），127.6（C-1'），123.1（C-6''），123.1（C-6'），116.4（C-5'，5''），115.1（C-8'，8''），114.7（C-2''），114.7（C-2'），75.94（C-2），69.5（C-1），69.0（C-3），39.5（C-5），38.4（C-4）?；衔?2的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[16]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為1，2-O-二咖啡?；?3-羥基-環(huán)戊醇。

化合物13：淡黃色粉末狀物質；分子式為C25H24O12；ESI＋-MSm/z：517 [M＋H]＋；1H-NMR（CD3OD，400 MHz）：7.59（1H，d，J＝15.9 Hz，H-7'，H-7''），7.51（1H，d，J＝15.9 Hz，H-7'，H-7''），7.02（1H，d，J＝1.8 Hz，H-2'，H-2''），7.00（1H，d，J＝1.8 Hz，H-2'，H-2''），6.92（1H，dd，J＝8.1，1.8 Hz，H-6'，H-6''），6.90（1H，dd，J＝8.1，1.8 Hz，H-6'，H-6''），6.75（1H，d，J＝8.1 Hz，H-5'，H-5''），6.74（1H，d，J＝8.1 Hz，H-5'，H-5''），6.28（1H，d，J＝15.9 Hz，H-8'，H-8''），6.19（1H，d，J＝15.9 Hz，H-8'，H-8''），5.62（1H，brs，H-5），5.11（1H，brs，H-4），4.37（1H，brs，H-3），2.40（2H，H-6），1.99（2H，m，H-2）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）：168.7（C-9'，9''），168.6（C-9'，9''），149.6（C-4'，4''），147.6（C-7'，7''），147.4（C-7'，7''），146.7（C-3'，3''），146.7（C-3'，3''），127.8（C-1'，1''），127.6（C-1'，1''），123.3（C-6'，6''），117.5（C-8'，8''），116.4（C-5'，5''），115.1（C-2'，2''），115.0（C-2'，2''），114.7（C-8'，8''），76.5（C-1），75.7（C-2），70.2（C-3），69.2（C-5），40.2（C-6），38.5（C-14）。化合物13的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[17]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為4，5-O-二咖啡酰基奎寧酸。

化合物14：淡黃色粉末狀物質；分子式為C9H8O4；ESI＋-MSm/z：203 [M＋Na]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.54（1H，d，J＝16.0 Hz，H-7），7.04（1H，d，J＝1.7 Hz，H-2），6.92（1H，dd，J＝1.7，8.2 Hz，H-5），6.78（1H，d，J＝8.2 Hz，H-6），6.22（1H，d，J＝16.0 Hz，H-8）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：171.0（C-9），149.4（C-4），147.0（C-7），146.7（C-3），127.7（C-1），122.8（C-6），116.4（C-8），115.5（C-5），115.0（C-2）?；衔?4的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[18]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為咖啡酸。

化合物15：白色粉末狀物質；分子式為C16H18O9；ESI＋-MSm/z：355 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.55（1H，d，J＝16.0 Hz，H-7'），7.04（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2'），6.95（1H，dd，J＝8.4，2.0 Hz，H-6'），6.77（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5'），6.25（1H，d，J＝16.0 Hz，H-8'），5.32（1H，m，H-3），4.15（1H，m，H-5），3.72（1H，dd，J＝8.4，3.2 Hz，H-4），2.25～2.01（4H，m，H-2，H-6）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：176.9（COOH），168.6（C-9'），149.5（C-4'），147.0（C-7'），146.8（C-3'），127.7（C-1'），122.9（C-6'），116.4（C-5'，8'），115.2（C-2'），76.1（C-1），73.4（C-4），71.9（C-5），71.2（C-3），38.7（C-2），38.2（C-6）。化合物15的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[19]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為綠原酸。

化合物16：白色粉末狀物；分子式為C17H24O9；ESI＋-MSm/z：395 [M＋Na]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.74（2H，s，H-3，5），6.54（1H，d，J＝16.1 Hz，H-7），6.37（1H，dt，J＝5.5，15.8 Hz，H-8），4.86（1H，s，H-1'），4.22（2H，d，J＝5.0 Hz，H-9），3.85（6H，s，-OCH3），3.78（1H，dd，J＝2.1，11.9 Hz，H-6'a），3.66（1H，dd，J＝11.8，5.2 Hz，H-6'b），3.48（1H，m，H-2'），3.42（2H，m，H-3'，4'），3.21（1H，m，H-5'）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：154.3（C-3，5），135.8（C-4），135.2（C-7），131.2（C-1），130.0（C-8），105.4（C-2，6），105.3（C-1'），78.3（C-5'），77.8（C-3'），75.7（C-2'），71.3（C-4'），63.5（C-9），62.5（C-6'），57.0（-OCH3）?；衔?6的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[20]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為紫丁香苷。

化合物17：淡黃色粉末狀物質；分子式為C28H32O16；ESI＋-MSm/z：647 [M＋Na]＋；1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.66（1H，overlapped，H-2'），7.63（1H，overlapped，H-6'），6.87（1H，d，J＝7.4 Hz，H-5'），6.41（1H，s，H-8），6.21（1H，s，H-6），5.11（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1''），4.52（1H，s，H-1'''），3.34～3.80（8H，m，H-2''，3''，4''，5''，2'''，3'''，4'''，5'''），1.12（3H，d，J＝5.9 Hz，H-6'''）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δ：179.4（C-4），166.0（C-7），162.9（C-5），159.3（C-2），158.5（C-9），149.8（C-4'），145.8（C-3'），135.6（C-3），123.5（C-6'），123.1（C-1'），117.6（C-5'），116.0（C-2'），105.6（C-10），104.7（C-1''），102.4（C-1'''），99.9（C-6），94.8（C-8），78.1（C-3''），77.2（C-5''），75.7（C-2''），73.9（C-4''），72.2（C-5'''），72.0（C-3'''），71.3（C-4'''），69.7（C-6''），68.5（C-2'''），17.8（C-6'''）。化合物17的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[21]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為蘆丁。

化合物18：淡黃色油狀物；分子式為C19H30O8；ESI＋-MSm/z：387 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：5.82（1H，s，H-4），4.25（1H，d，J＝7.7 Hz，H-1'），3.87（1H，d，J＝11.7 Hz，H-6'b）3.80（1H，d，J＝9.5 Hz，H-6'a），3.67～3.26（3H，m，H-11），3.44（1H，d，J＝9.5 Hz，H-5'），3.33（1H，m，H-3'），3.19（1H，t，J＝8.1 Hz，H-2'），2.71（2H，m，H-8），2.54（2H，d，J＝17.8 Hz，H-2），2.52（1H，brs，H-2a），2.24（1H，t，J＝5.1 Hz，H-6），2.14（3H，s，H-10）2.04（3H，s，H-13），2.00～1.65（2H，m，H-7），1.07（2H，s，H-12）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：211.6（C-9），201.2（C-3），169.1（C-5），125.9（C-4），104.4（C-1'），78.1（C-5'），78.0（C-3'），75.9（C-11），75.6（C-2'），71.7（C-4'），63.2（C-6'），46.2（C-6），43.1（C-2），42.9（C-8），40.9（C-1），30.0（C-10），24.7（C-13），24.4（C-7），24.2（C-12）?；衔?8的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[22]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為supinaionodie B。

化合物19：白色粉末狀物質；分子式為C11H15N5O4；ESI＋-MSm/z：304 [M＋Na]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：8.33（1H，s，H-2），8.18（1H，s，H-8），6.06（1H，d，J＝6.0 Hz，H-1'），4.49（1H，m，H-2'），4.43（1H，m，H-3'），4.16（1H，m，H-4'），3.88（1H，dd，J＝2.1，12.5 Hz，H-5'a），3.75（1H，dd，J＝2.4，12.5 Hz，H-5'b）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：157.5（C-6），153.6（C-2），149.9（C-4），141.8（C-8），120.9（C-5），89.2（C-1'），88.4（C-4'），84.6（C-2'），70.8（C-3'），63.2（C-5'），58.7（2'-OCH3）?；衔?9的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[23]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為cordysinin B。

化合物20：白色粉末狀物質；分子式為C10H13N5O5；ESI＋-MSm/z：306 [M＋Na]＋；1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.64（1H，s，3-NH），7.94（1H，s，H-8），6.49（2H，s，2-NH2），5.69（1H，d，J＝6.0 Hz，1'-OH），5.39（1H，d，J＝6.0 Hz，2'-OH），5.07（1H，d，J＝4.7 Hz，H-1'），5.01（1H，t，J＝5.5 Hz，3'-OH），4.39（1H，m，H-2'），4.08（1H，m，H-3'），3.87（1H，dd，J＝3.7，7.3 Hz，H-4'），3.52～3.61（2H，m，H-5'）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ：156.7（C-6），153.5（C-2），151.3（C-4），135.5（C-8），116.9（C-5），86.3（C-1'），85.1（C-4'），73.6（C-3'），70.3（C-2'），61.3（C-5'）?；衔?0的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[24]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為鳥嘌呤核苷。

化合物21：白色粉末狀物質；分子式為C10H13N5O4；ESI＋-MSm/z：268 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：8.35（1H，s，H-8），8.14（1H，s，H-2），7.35（2H，s，NH2），5.87（1H，d，J＝6.2 Hz，H-1'），5.45（1H，d，J＝6.1 Hz，2'-OH），5.42（1H，d，J＝6.2 Hz，3'-OH），5.19（1H，d，J＝4.6 Hz，3'-OH），4.62（1H，m，H-2'），4.15（1H，m，H-3'），3.97（1H，d，J＝2.68 Hz，H-4'），3.53～3.70（2H，m，H-5'）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ：156.1（C-6），152.4（C-2），149.0（C-4），139.9（C-8），119.3（C-5），87.9（C-1'），85.9（C-4'），73.4（C-2'），70.6（C-3'），61.7（C-5'）?；衔?1的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[24]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為腺嘌呤核苷。

化合物22：白色粉末狀物質；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：9.02（1H，brs，H-2），8.68（1H，d，J＝4.2 Hz，H-6），8.28（1H，d，J＝7.9 Hz，H-4），7.54（1H，dd，J＝4.9，7.8 Hz，H-5）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：169.8（C-1），152.8（C-2），149.4（C-6），137.3（C-4），131.4（C-3），125.1（C-5）?；衔?2的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[25]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為煙酰胺。

4 化合物的活性研究

4.1 化合物對一氧化氮（NO）生成抑制活性研究

將RAW264.7細胞接種至96孔板中，用1 μg·mL－1LPS進行誘導刺激，同時加入待測化合物（50 μmol·L－1）處理，L-NMMA為陽性對照。細胞過夜培養(yǎng)后取培養(yǎng)基在570 nm處測定吸光值，檢測NO生成。結果表明所有化合物均未表現(xiàn)出明顯的NO生成抑制活性。

4.2 化合物對環(huán)氧化酶1和2的抑制活性研究

對分離得到的化合物采用環(huán)氧化酶抑制劑篩選試劑盒進行環(huán)氧化酶1和2的抑制活性篩選，以阿司匹林和帕瑞昔布為陽性對照。結果表明所有化合物均未表現(xiàn)出明顯的環(huán)氧化酶1和2抑制活性。

4.3 化合物的抗菌活性研究

參照CLSI標準檢測分離得到的化合物對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、腸沙門氏菌、銅綠假單胞菌的抑制作用，以青霉素G鈉為陽性對照。實驗結果表明化合物4、6、8、15對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出一定的抑制作用，結果見表1。

表1 化合物對金黃色葡萄球菌的抑制率Tab 1 Inhibition rate of the isolated compound on Staphylococcus aureus

采用微量稀釋法對分離得到的化合物進行口腔厭氧菌[牙齦卟啉單胞菌（Pg）、具核梭桿菌具核亞種（Fn）、變異鏈球菌（Sm）]抑制活性篩選，以氨芐西林為陽性對照。結果表明化合物4、5、8、18、19對牙齦卟啉單胞菌（Pg）、具核梭桿菌具核亞種（Fn）表現(xiàn)出微弱的抑制作用，化合物2、5、11、19分別在半數(shù)抑菌濃度（MIC50）為200、200、100、200 μg·mL－1時對變異鏈球菌（Sm）顯示出與陽性對照相當（氨芐西林 200μg·mL－1）的抑制作用。

5 結論

本文運用色譜、光譜法等方法對金銀花乙醇提取物進行了較為系統(tǒng)的化學成分分離。共分離鑒定了22個單體化合物，主要包括環(huán)烯醚萜苷類（1～11），核苷類（19～21），生物堿類（22），黃酮類（17），苯丙素類（16），倍半萜類（18）以及酚酸類（12～15）成分；其中化合物11、12、18、22首次在金銀花中分離得到?；钚匝芯拷Y果表明，本文從金銀花中分離的化學成分化合物2、5、11、19在MIC50為200、200、100、200μg·mL－1時對變異鏈球菌（Sm）顯示出與陽性對照相當（氨芐西林 200 μg·mL－1）的抑制作用，這也表明金銀花清熱解毒的傳統(tǒng)功效和其抗菌活性有一定的關聯(lián)。本次研究進一步豐富了金銀花的化學物質組成和生物活性信息，可為金銀花的開發(fā)利用提供參考。