麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜及抗氧化活性研究

張勝娜，周衡樸，劉英杰，吳素香，林潔，朱志紅*（.瑞安市中醫(yī)院，浙江 瑞安 500；.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 400；.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江 瑞安 500）

麩炒枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)枳殼的炮制品，用于理氣寬中，行滯消脹等[1-3]。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑能作為一種標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)化不同的臨床用藥形式，提高用藥的準(zhǔn)確性和劑量的一致性[4-7]；中藥配方顆粒是傳統(tǒng)中藥飲片、湯劑的改良產(chǎn)品，是中藥現(xiàn)代化的重要成果，中藥飲片經(jīng)提取研究制備成標(biāo)準(zhǔn)湯劑，然后采用不同的方法制成中藥配方顆粒，因此對(duì)中藥飲片的標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行質(zhì)量控制也是有必要的。本研究遵循標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備要求，制備麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑，采用冷凍干燥技術(shù)將其制備成標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，計(jì)算出膏率，以柚皮苷和新橙皮苷為指標(biāo)成分，測(cè)定其含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率，建立指紋圖譜，為建立麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考；同時(shí)進(jìn)行體外抗氧化活性研究，為麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑的臨床應(yīng)用及麩炒枳殼配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀（美國(guó)Waters科技有限公司）；Free Zone 2.5L冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Labconco公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；Synergy H1酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰公司）。

1.2 試藥

柚皮苷（批號(hào)：110722-201815，純度≥98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院），新橙皮苷（批號(hào)：200155-160801，純度≥98%，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司），維生素C（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20240706），DPPH自由基清除能力試劑盒、羥自由基清除能力試劑盒、總抗氧化能力試劑盒（江蘇艾迪生生物科技有限公司，批號(hào)：G20220114S），甲醇、乙腈（色譜級(jí)，美國(guó)天地有限公司），水為超純水，其他試劑為分析級(jí)。

1.3 藥材

麩炒枳殼共15批（FZK1～ FZK15），經(jīng)瑞安市中醫(yī)院副主任中藥師劉英杰鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)枳殼的炮制品。經(jīng)檢驗(yàn)均符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定，樣品來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 麩炒枳殼飲片的來(lái)源Tab 1 Source of Aurantii Fructus Praeparatus

2 方法與結(jié)果

2.1 麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的制備及出膏率的測(cè)定

稱(chēng)取15批麩炒枳殼飲片各100 g，煎煮2次。一煎加入飲片8倍量水，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸30 min。二煎加入飲片6倍量水，武火煮沸，文火保持微沸30 min。趁熱用3層紗布濾過(guò)，合并2次濾液，50℃減壓濃縮至100 mL，冷凍干燥，得標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，計(jì)算出膏率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑測(cè)定結(jié)果Tab 2 Determination of Aurantii Fructus Praeparatus standard decoction

2.2 柚皮苷、新橙皮苷的測(cè)定

2.2.1 液相色譜條件 色譜柱：Agilent SB-C18（4.5 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（20∶80）（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3）；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；流速：1 mL·min－1；進(jìn)樣量：10 μL；溫度：30℃。供試品及對(duì)照品圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC圖譜Fig 1 HPLC chromatogram of Aurantii Fructus Praeparatus standard decoction

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每l mL分別含柚皮苷和新橙皮苷80.19 μg、79.08 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取麩炒枳殼凍干粉或藥材粉末約0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)重，加熱回流1.5 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取柚皮苷4.90 mg、新橙皮苷4.80 mg，用甲醇配制成含柚皮苷7.65～980.00 μg·mL－1、新橙皮苷7.50～960.00 μg·mL－1的系列對(duì)照品溶液，以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X，μg·mL－1）進(jìn)行線(xiàn)性回歸。結(jié)果柚皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：Y＝1.22×105X＋6.67×105，r＝0.9994，柚皮苷在7.65～980.00 μg·mL－1與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好；新橙皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：Y＝1.43×105X＋1.87×105，r＝0.9994，新橙皮苷在7.50～960.00 μg·mL－1與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣6次，結(jié)果柚皮苷和新橙皮苷峰面積RSD均為1.3%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取麩炒枳殼凍干粉（批號(hào)：181101）約0.2 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，放置0、2、4、6、8、24 h后進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得柚皮苷和新橙皮苷峰面積RSD分別為1.3%和2.2%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取麩炒枳殼凍干粉（批號(hào)：181101）6份，每份約0.2 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果柚皮苷和新橙皮苷含量RSD均為1.7%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取6份同一批已知柚皮苷、新橙皮苷含量的麩炒枳殼凍干粉40 mg，加入柚皮苷、新橙皮苷含量100%的對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。柚皮苷和新橙皮苷平均加樣回收率分別為100.25%和100.76%，RSD分別為0.85%和0.81%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.3 樣品的含量測(cè)定

取15批麩炒枳殼凍干粉供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，使用外標(biāo)兩點(diǎn)法制作隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算柚皮苷、新橙皮苷含量。進(jìn)樣測(cè)定峰面積，測(cè)定15批麩炒枳殼中柚皮苷、新橙皮苷含量[1]，計(jì)算轉(zhuǎn)移率。

轉(zhuǎn)移率（%）＝凍干粉中指標(biāo)成分含量/飲片中指標(biāo)成分含量×100%

15批麩炒枳殼的出膏率為10.42%～16.51%；柚皮苷的含量為7.27%～12.81%，轉(zhuǎn)移率為19.04%～42.26%；新橙皮苷含量為4.98%～8.72%，轉(zhuǎn)移率為13.87%～24.19%（見(jiàn)表2）。

2.4 麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件色譜柱：Agilent SB-C18（4.5 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～20 min，25%～40%A；20～44 min，42%～62%A；44～50 min，62%～80%A；50～60 min，80%～100%A；60～70 min，100%～25%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；流速：1 mL·min－1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣6次，測(cè)得柚皮苷保留時(shí)間和峰面積RSD分別為0.15%和2.4%，新橙皮苷保留時(shí)間和峰面積RSD分別為0.16%和2.5%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取麩炒枳殼凍干粉（批號(hào)：181101）約0.2 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，放置0、2、4、6、8、24 h后，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果柚皮苷保留時(shí)間和峰面積RSD分別為0.76%和4.1%，新橙皮苷保留時(shí)間和峰面積RSD分別為0.83%和4.1%，說(shuō)明柚皮苷和新橙皮苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取麩炒枳殼凍干粉（批號(hào)：181101）6份，每份約0.2 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，柚皮苷保留時(shí)間和峰面積RSD分別為0.18%和3.0%，新橙皮苷保留時(shí)間和峰面積RSD分別為0.21%和4.8%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 指紋圖譜相似度分析 精密吸取各批供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀得指紋圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件進(jìn)行色譜峰匹配，找出共有峰。結(jié)果表明15批麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中共出現(xiàn)12個(gè)共有峰，且分離度較好，見(jiàn)圖2。以FZK1為參照，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A）軟件，分析色譜數(shù)據(jù)，計(jì)算相似度，依次為0.988、0.992、0.989、0.989、0.993、0.997、0.995、0.993、0.992、0.993、0.981、0.966、0.992、0.988、0.988，15批麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑相似度均大于0.95，符合指紋圖譜要求（大于0.9）。

圖2 麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜Fig 2 Fingerprints of Aurantii Fructus Praeparatus standard decoction 6.柚皮苷（naringin）；8.新橙皮苷（neohesperidin）

2.4.6 聚類(lèi)分析 將共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 26進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。15批麩炒枳殼可分為兩類(lèi)：I類(lèi)是FZK2、FZK3、FZK4、FZK6、FZK7、FZK11、FZK12，Ⅱ類(lèi)是FZK1、FZK5、FZK8、FZK9、FZK10、FZK13、FZK14、FZK15。結(jié)果表明不同產(chǎn)地不同批次的麩炒枳殼存在一定差異。

圖3 麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑聚類(lèi)分析圖Fig 3 Cluster analysis of Aurantii Fructus Praeparatus standard decoction

2.4.7 主成分分析 使用SPSS 26軟件對(duì)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析，設(shè)定特征值大于1，結(jié)果見(jiàn)表3。共篩選出3個(gè)主成分，第3個(gè)成分的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)83.831%。表明多種成分引起麩炒枳殼的質(zhì)量差異，且前3個(gè)主成分能反映麩炒枳殼的基本特征。以這3個(gè)成分繪制主成分平面得分圖（見(jiàn)圖4），可將樣品分為兩類(lèi)，與聚類(lèi)分析結(jié)果一致。

圖4 主成分得分圖Fig 4 Principal component score

表3 主成分方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis of principal component

2.5 體外抗氧化作用

2.5.1 供試品溶液的配制

① 麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液：取一定量的麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，用純水配制成1、10、50、100、500、1000、2500 μg生 藥·mL－1系列質(zhì)量濃度的供試品溶液，備用。

② 麩炒枳殼藥材供試品溶液：取麩炒枳殼藥材，用80%乙醇回流提取2次，每次60 min，回收乙醇，濃縮液冷凍干燥，凍干粉用純水配制成1、10、50、100、500、1000、2500 μg生藥·mL－1系列質(zhì)量濃度的供試品溶液，備用。

③ 維生素C供試品溶液：取一定量的維生素C，純水配制成1、10、50、100、500、1000、2500 μg·mL－1系列質(zhì)量濃度的供試品溶液，備用。注意避光。

2.5.2 體外抗氧化試驗(yàn) 按說(shuō)明書(shū)中方法，以維生素C和水溶性維生素E（Trolox）為對(duì)照，進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 各成分的ABTS自由基清除能力（A）、DPPH自由基清除能力（B）、總抗氧化能力（C）Fig 5 Scavenging effect of Aurantii Fructus Praeparatus standard decoction on ABTS（A），DPPH（B）and total antioxidant capacity（C）

ABTS自由基清除能力結(jié)果顯示，當(dāng)質(zhì)量濃度為2500 μg·mL－1時(shí)，枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑ABTS自由基清除能力可達(dá)（80.42±11.93）%，稍弱于維生素C，強(qiáng)于枳殼藥材。說(shuō)明枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑和枳殼藥材具有一定的抗氧化能力，且枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑＞枳殼藥材。

DPPH自由基清除能力結(jié)果顯示，當(dāng)質(zhì)量濃度為2500 μg·mL－1時(shí)，枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑DPPH自由基清除能力可達(dá)（94.98±8.65）%，與維生素C的清除能力相當(dāng)，說(shuō)明枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑和枳殼藥材具有良好的DPPH自由基清除能力。

總抗氧化能力結(jié)果顯示，當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg·mL－1時(shí)，維生素C的Frap值為（0.4756±0.0211），枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑的Frap值為（0.1847±0.0258），枳殼藥材的Frap值為（0.1576±0.0132），說(shuō)明枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑和枳殼藥材有一定的總抗氧化能力。

3 討論

3.1 色譜條件的篩選

在建立麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的過(guò)程中，考察了甲醇、乙腈、磷酸水等作為流動(dòng)相以及不同流動(dòng)相梯度對(duì)指紋圖譜的影響，最終確定了以甲醇-水為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，流速為1 mL·min－1，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30℃，此時(shí)色譜峰數(shù)最多且分離度均較好。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制

2020年版《中國(guó)藥典》中，枳殼的含量測(cè)定指標(biāo)是柚皮苷和新橙皮苷，麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑中柚皮苷和新橙皮苷的含量和轉(zhuǎn)移率均較高，體現(xiàn)了其質(zhì)量穩(wěn)定、有效成分含量高。麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中特征峰超過(guò)10個(gè)，各批次麩炒枳殼圖譜相似度高，該方法適用于麩炒枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制。

3.3 抗氧化作用

本試驗(yàn)比較了枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑和枳殼藥材的體外抗氧化活性，枳殼標(biāo)準(zhǔn)湯劑和枳殼藥材均具有一定的抗氧化能力，但測(cè)得的幾項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑抗氧化活性均強(qiáng)于藥材?？赡苁菢?biāo)準(zhǔn)湯劑中多糖、苷類(lèi)、蛋白質(zhì)、氨基酸等水溶性成分含量較高，且這些成分均具有一定的抗氧化作用[8-9]。

3.4 小結(jié)

枳殼含有黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)等成分，柚皮苷和新橙皮苷為黃酮類(lèi)的主要成分，麩炒后含量均略微下降[10]。本試驗(yàn)可為麩炒枳殼飲片的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。