動(dòng)脈粥樣硬化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及方法的研究進(jìn)展*

楊定法，趙慶宇婧 綜述，顏紅嬌，趙聲蘭△ 審校

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650500；2.昆明海關(guān)技術(shù)中心 650100)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種慢性血管疾病，是許多心血管病的基礎(chǔ)，例如冠心病、動(dòng)脈疾病、急性心肌梗死等。2020年中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告推算中國(guó)約3.30億人患心血管病，其患病率一直持續(xù)升高，其病死率位列各疾病之首[1]。AS致病因素包括遺傳、年齡、飲食習(xí)慣、高血糖、高血脂和高血壓等。2016年中國(guó)大約有240萬人死于AS，占心血管疾病死亡人數(shù)的61%，占所有死亡人數(shù)的25%[2]。2020年在全球30～79歲人群中，約有19.4億人患有不同發(fā)展時(shí)期的AS病癥，AS已嚴(yán)重影響著人類的健康[3]。

AS病變由輕到重有6型：Ⅰ型是最初的病變，動(dòng)脈內(nèi)膜適應(yīng)性增厚，大量脂蛋白誘導(dǎo)內(nèi)膜巨噬細(xì)胞增多并形成充滿脂滴的巨噬泡沫細(xì)胞[4-5]。Ⅱ型病變主要包括脂肪條紋，肉眼可見動(dòng)脈內(nèi)膜表面的黃色條紋、斑塊或斑點(diǎn)。Ⅲ型病變也稱為中間病變、過渡性病變和AS前病變，在動(dòng)脈內(nèi)膜適應(yīng)性增厚的平滑肌細(xì)胞層之間形成脂質(zhì)池。Ⅳ型病變細(xì)胞外脂質(zhì)積聚形成脂核(脂質(zhì)核心)，脂質(zhì)核心引起了嚴(yán)重的內(nèi)膜紊亂，使動(dòng)脈壁增厚，內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞和深層內(nèi)膜的細(xì)胞間基質(zhì)排列分散等。Ⅴ型病變有明顯的新纖維結(jié)締組織形成，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂、數(shù)量減少，動(dòng)脈出現(xiàn)不同程度的狹窄。Ⅵ型病變是復(fù)雜病變，在Ⅳ型和Ⅴ型病變的基礎(chǔ)上出現(xiàn)病變斑塊表面的破裂、血腫或出血及血栓沉積等。

目前，構(gòu)建AS實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型主要通過高膽固醇、高脂肪飲食誘導(dǎo)形成，但與人體病變相比，并不完全一致。在大多數(shù)AS實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，動(dòng)物并不總是按照預(yù)想，發(fā)展形成斑塊破裂、心肌梗死和猝死等并發(fā)癥[6-7]。理想的AS模型應(yīng)與人體病變相似，且能應(yīng)用于相關(guān)醫(yī)藥研究中。所以構(gòu)建一種與人類發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)相似或接近的動(dòng)物模型是探究AS發(fā)病機(jī)制和研發(fā)有效治療藥物的關(guān)鍵。

1 動(dòng) 物

用作AS模型的動(dòng)物須易于獲得，能以合理的成本維護(hù)，容易處理并具有明確的遺傳特征[8]。此外，動(dòng)物最好在食用與人類相似的飲食后能自發(fā)發(fā)生病變。目前，常用于建立AS模型的動(dòng)物包括大鼠、小鼠、豚鼠、小型豬和家兔等，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，見表1。

表1 幾種常用AS模型動(dòng)物的比較

1.1大鼠

大鼠長(zhǎng)期給予膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶以及高脂肪、高膽固醇的飲食能發(fā)展成AS病變，但同時(shí)伴有體重明顯減輕和病死率高。建立動(dòng)物模型通常選擇6～8周齡雄性Wistar或SD大鼠。ZHAO等[9]選用SD大鼠，給予高脂飲食(總膽固醇3.0%，基礎(chǔ)飼料81.3%，豬油10.0%，蔗糖5.0%，丙基硫氧嘧啶0.2%，膽酸鈉0.5%)喂養(yǎng)9周，結(jié)合維生素D3建立AS大鼠模型。

1.2小鼠

C57BL/6J純系小鼠能用來構(gòu)建AS模型，含15%脂肪、1.25%膽固醇、0.5%膽酸的高脂飲食喂養(yǎng)14周會(huì)形成高膽固醇血癥和散在的脂肪斑塊等AS病變，但病變較小，沒有進(jìn)展到纖維斑塊[10]。隨著胚胎操作技術(shù)與DNA同源重組技術(shù)的成熟與應(yīng)用，出現(xiàn)了基因改造小鼠。現(xiàn)在普遍認(rèn)為基因改造小鼠是檢測(cè)AS特定基因靶點(diǎn)缺失或過度表達(dá)最重要的動(dòng)物模型，它對(duì)研究AS分子機(jī)制和有潛在價(jià)值的途徑非常重要。目前常用的基因改造小鼠有ApoE-/-小鼠和LDLr-/-小鼠。研究發(fā)現(xiàn)普通飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠可形成AS斑塊，LDLr-/-小鼠只會(huì)出現(xiàn)小病變[11]；高脂飲食誘導(dǎo)，ApoE-/-小鼠比LDLr-/-小鼠病變的速度更快，所以ApoE-/-模型更廣泛用于實(shí)驗(yàn)性AS研究[12]。

1.3豚鼠

豚鼠與人類有許多相似之處，包括擁有多種代謝脂蛋白的酶，脂蛋白代謝與人類類似；顯示出與人類相似的肝膽固醇合成和分解代謝速率；豚鼠和人類在從血漿中清除LDL的機(jī)制上具有相似之處等。豚鼠對(duì)高膽固醇飲食十分敏感，通常豚鼠攝入高膽固醇飼料一段時(shí)間后即可形成早期AS斑塊。

1.4家兔

家兔是AS研究使用較多的動(dòng)物之一。它的脂蛋白譜與人類相似，表達(dá)膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白，且吸收外源性膽固醇能力強(qiáng)，容易形成AS病變[13]。構(gòu)建AS模型兔通常選取3～4月齡的新西蘭大耳白兔或日本大耳白兔，單獨(dú)喂食高膽固醇飲食或聯(lián)合動(dòng)脈球囊損傷等方法，誘導(dǎo)主動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化病變[8]。值得注意的是，新西蘭大耳白兔長(zhǎng)期高膽固醇喂養(yǎng)易導(dǎo)致高膽固醇血癥，大量炎癥和肝毒性發(fā)展，導(dǎo)致脂肪肝和黃疸等。IZIDORO等[14]采用高膽固醇飲食(0.2%)加腹主動(dòng)脈球囊內(nèi)皮剝脫術(shù)誘導(dǎo)新西蘭白兔，建立實(shí)驗(yàn)性AS模型。

1.5小型豬

小型豬是構(gòu)建AS動(dòng)物模型較為理想的動(dòng)物。從生理、生化及解剖學(xué)等角度看，小型豬和人類都很像，其大動(dòng)脈的解剖結(jié)構(gòu)90%與人相同，低密度脂蛋白結(jié)構(gòu)和載脂蛋白等與人類似。由于上述相似性，小型豬AS模型可作為架橋工具，將從大鼠、小鼠等其他小動(dòng)物模型研究中獲得的知識(shí)轉(zhuǎn)化為人類AS藥物的開發(fā)[15]。ZHAO等[16]通過給予近交系五指山小型豬高膽固醇高脂飲食，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)6個(gè)月腹主動(dòng)脈和髂動(dòng)脈出現(xiàn)斑塊病變，8個(gè)月冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)斑塊病變，12個(gè)月所有的主要?jiǎng)用}都發(fā)現(xiàn)AS病變，最嚴(yán)重的部位出現(xiàn)了脂核、膽固醇沉淀和鈣沉積。

利用CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)，以AS模型為主題檢索2010-2020年的相關(guān)文獻(xiàn)，然后再分別以大鼠、小鼠、豚鼠、兔、小型豬為主題在結(jié)果中檢索。使用大鼠和小鼠建立AS模型的相關(guān)文獻(xiàn)較多，且越來越多的研究者選擇ApoE-/-小鼠；使用小型豬和豚鼠的相對(duì)較少。

2 高脂飼料誘導(dǎo)

AS的表征之一是血脂質(zhì)積聚，是動(dòng)物長(zhǎng)期食用高膽固醇、高脂飲食的結(jié)果。高脂飼料配方依據(jù)模型動(dòng)物、造模方法、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜅l件的差異而定，通常是普通飼料加適量的膽固醇、豬油、白糖、蛋黃粉等組成。豬油可使飼料更好成形，白糖可以改善高脂飼料的口感，增加動(dòng)物的食欲。值得注意的是大鼠和C57BL/6J純系小鼠具有抗AS的特性，在選取它們建立模型時(shí)，高脂飼料中需添加丙基硫氧嘧啶和膽酸鈉[17]。丙基硫氧嘧啶能抑制甲狀腺功能、降低膽固醇代謝；膽酸鈉可提高腸道對(duì)脂肪和膽固醇的吸收[18]。

高脂飼料誘導(dǎo)操作簡(jiǎn)便、成本低，且符合人類飲食的特點(diǎn)，但建模周期長(zhǎng)，模型不易成功，較難發(fā)展為晚期AS病變。以高脂喂養(yǎng)作為基礎(chǔ)，再聯(lián)合腹腔維生素D3、免疫炎癥誘導(dǎo)、機(jī)械損傷和基因改造等方法，可較好建立AS晚期動(dòng)物模型。但高脂飼料不同配方對(duì)血脂TG、TC和LDL-C等指標(biāo)的影響有一定差異(表2)。

表2 幾種高脂飼料配方及喂食相應(yīng)飼料后不同動(dòng)物模型血脂指標(biāo)變化率

3 高脂飼料結(jié)合維生素D3誘導(dǎo)

此方法主要用于構(gòu)建AS大鼠模型。維生素D3是鈣離子誘導(dǎo)劑，可誘發(fā)血管鈣化，升高血液中血鈣水平，損壞動(dòng)脈壁，加快AS病變。大鼠無膽囊，脂質(zhì)吸收率低，僅靠高脂飼料很難形成AS病變，高脂飼料誘導(dǎo)的同時(shí)給予維生素D3，能有效提高模型成功率。LIAN等[25]高脂飲食誘導(dǎo)的同時(shí)單次腹腔注射維生素D3，12周后大鼠形成了明顯AS病變。但該方法維生素D3的給藥劑量需嚴(yán)格控制，劑量過低或過高都影響模型的建立。目前不同研究者維生素D3給藥劑量和頻率有一定差異(表3)。

表3 維生素D3的幾種給藥劑量和給藥方式

4 免疫炎癥誘導(dǎo)

AS是一種慢性炎癥性的血管病變。炎性反應(yīng)貫穿了AS的所有階段：從內(nèi)膜中的脂質(zhì)蓄積到斑塊形成和最終破裂。細(xì)胞炎性因子的表達(dá)增加，炎性細(xì)胞的形成等都促進(jìn)了AS的發(fā)生與發(fā)展。炎癥誘導(dǎo)方法通過給予牛血清白蛋白、肺炎衣原體和幽門螺桿菌等形成免疫刺激，誘發(fā)免疫炎性反應(yīng)。

4.1病原體誘導(dǎo)法

病原體感染與AS病變密切相關(guān)。用于AS模型研究的病原體有幽門螺桿菌和肺炎衣原體等。幽門螺桿菌感染能讓巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等聚集，提高C-反應(yīng)蛋白、 IL-6、IL-8和TNF-α等的水平，誘導(dǎo)動(dòng)脈發(fā)生局部炎性反應(yīng)，內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子濃度升高，加速AS發(fā)展。肺炎衣原體會(huì)與血管細(xì)胞相互作用產(chǎn)生氧化應(yīng)激，進(jìn)一步促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成，并通過刺激血小板活化和VSMC增殖、遷移等促進(jìn)AS病變的形成。陶珍等[30]采用雄性新西蘭兔在喂食高脂飼料(1%膽固醇、15%鮮蛋黃、5%豬油、79%基礎(chǔ)飼料)的基礎(chǔ)上，經(jīng)耳緣靜脈注射幽門螺旋桿菌，成功建立兔AS模型。

4.2牛血清白蛋白法

唐曦等[31]比較兩種方式(僅給予高脂飼料：88.5%普通飼料、7.5%蛋黃粉、6%膽固醇、4%豬油；給予相同高脂飼料的同時(shí)，每周肌內(nèi)注射250 mg/kg胎牛血清白蛋白)構(gòu)建新西蘭大白兔AS模型，發(fā)現(xiàn)高脂飼料復(fù)合免疫損傷家兔血脂水平更高，粥樣斑塊病變更嚴(yán)重。劉劍剛等[32]用日本大耳白兔喂食高脂飼料，同時(shí)給予250 mg/kg牛血清白蛋白，15 d后再次給予250 mg/kg牛血清白蛋白，72 d后可以觀察到兔主動(dòng)脈有斑塊形成，血脂水平顯著增高。

5 機(jī)械損傷誘導(dǎo)

脂質(zhì)沉積與內(nèi)皮損傷是AS病變的兩大基本因素。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)，動(dòng)脈內(nèi)膜的完整性、通透性發(fā)生改變，脂質(zhì)積聚在受損內(nèi)膜處，形成泡沫細(xì)胞并不斷積累構(gòu)成脂肪斑塊，進(jìn)而形成AS斑塊。內(nèi)皮損傷包括直接損傷和間接損傷。

5.1球囊損傷法

該方法是通過球囊的膨脹和拖拉直接造成動(dòng)脈內(nèi)皮損傷和脫落。YANG等[33]采用反復(fù)球囊損傷腹主動(dòng)脈，結(jié)合高脂飼料的方法成功建立兔主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型。張莉等[34]采用球囊損傷術(shù)加高脂飼料(1%膽固醇、15%豬油、15%花生油、20%蛋黃粉、1%食鹽、48%普通飼料)連續(xù)飼喂小型豬12周后，頸總動(dòng)脈血管內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜及中膜均有泡沫細(xì)胞，動(dòng)脈壁上有不同程度的鈣化斑塊形成等。

5.2動(dòng)脈鉗夾術(shù)

該方法是物理阻斷動(dòng)脈的正常供血，間接造成頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，促進(jìn)AS斑塊的形成。王慶林等[35]給予大鼠高脂飲食 (10%蛋黃、8%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽鹽、4.8%食鹽)，并進(jìn)行頸動(dòng)脈鉗夾操作，6周后觀察到AS病變。李土明等[36]給予Wistar大鼠高脂飲食和腹腔注射維生素D3的同時(shí)進(jìn)行頸總動(dòng)脈鉗夾手術(shù)，構(gòu)建了頸總動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型。

6 基因改造動(dòng)物模型

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指把外源基因穩(wěn)定整合在動(dòng)物染色體基因組內(nèi)，并且能遺傳給后代的一類動(dòng)物。大量研究表明，ApoE敲除鼠和LDL受體基因敲除鼠動(dòng)脈可發(fā)生明顯的AS病變，且具有人類粥樣斑塊的典型特征，是研究AS最重要、最常用、最經(jīng)典的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。近年超過95%的AS研究都是基于載脂蛋白E缺乏或低密度脂蛋白受體缺乏的動(dòng)物[37]。

6.1ApoE基因敲除小鼠模型

ApoE是一種糖蛋白，主要在肝臟和大腦中合成，是除低密度脂蛋白外所有脂蛋白顆粒的結(jié)構(gòu)成分。它在脂蛋白代謝中發(fā)揮重要作用，還能抑制脂蛋白氧化，減少OxLDL等形成，減少泡沫細(xì)胞的形成[38]。1992年P(guān)IEDRAHITA等通過胚胎干細(xì)胞的同源重組技術(shù)成功地復(fù)制出ApoE基因敲除小鼠，以基因?yàn)榘悬c(diǎn)的小鼠模型改變了AS研究的面貌，形成了新的AS理論[39]。ApoE-/-小鼠清除血漿脂蛋白的能力嚴(yán)重受損，在正常飲食下，乳糜粒殘留物、極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白膽固醇含量明顯升高，血漿總膽固醇濃度達(dá)3～5 mg/mL。此外，缺乏ApoE會(huì)增加對(duì)飲食脂肪和膽固醇的敏感性，喂食高膽固醇、高脂肪飲食后，血漿膽固醇水平會(huì)進(jìn)一步升高，加速AS病變的進(jìn)程[40]。

6.2LDL-R基因敲除小鼠模型

LDL受體是一種膜受體，通過介導(dǎo)富含膽固醇的LDL的胞吞作用來維持血漿LDL水平，還參與相關(guān)脂蛋白內(nèi)化和代謝。1993年ISHIBASHI等以基因打靶技術(shù)成功培養(yǎng)LDL-R基因敲除小鼠，其血漿中脂蛋白增多，血膽固醇水平升高，易形成AS病變。該模型的特點(diǎn)有：首先，血漿膽固醇主要由LDL顆粒攜帶，脂質(zhì)分布和人類更相似。其次，由于缺乏功能性LDL受體，LDLr-/-小鼠模型能觀察到在人類家族性高膽固醇血癥中出現(xiàn)的特征。最后，與ApoE缺乏癥相比，LDL受體的缺乏對(duì)炎癥沒有影響。因此，該小鼠模型中的AS斑塊形成主要是基于血漿脂質(zhì)水平升高，而與炎癥和LDL受體相關(guān)的其他功能無關(guān)。

6.3其他轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型

ApoE/LDL受體雙敲除小鼠是一種可自發(fā)形成AS病變的動(dòng)物模型，在規(guī)律飲食的情況下，病變情況比ApoE-/-小鼠或LDLr-/-小鼠都更嚴(yán)重。ApoE3-leiden小鼠能表達(dá)可檢測(cè)的內(nèi)源性ApoE水平，這為研究升高的血脂質(zhì)水平而不干擾炎癥過程提供了可能性[41]，當(dāng)喂食高膽固醇、高脂飲食時(shí)，血漿總膽固醇和甘油三酯水平大幅升高，形成晚期AS病變。ApoE-/-兔在正常飲食中表現(xiàn)出輕度高脂血癥，對(duì)膽固醇飲食誘導(dǎo)的AS高度敏感[42]。此外，國(guó)內(nèi)外研究者還建立了PCSK9-AAV小鼠、ApoE-/-小型豬、ApoE-/-大鼠、LDLr-/-大鼠、LDLr-/-兔等多種AS轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。

簡(jiǎn)而言之，人們做出了許多研究來建立盡可能類似于人的AS動(dòng)物模型，然而當(dāng)前的每種動(dòng)物模型都有其優(yōu)點(diǎn)和局限性，人們通常只能根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和條件選擇合適的模型。建立自發(fā)性(即沒有機(jī)械干預(yù))斑塊破裂、盡可能具有類似于人的AS病變進(jìn)程，最終能發(fā)展形成卒中、猝死或心肌梗死等的動(dòng)物模型仍需進(jìn)一步研究。