長非編碼RNA在兒童腸息肉中的差異表達(dá)*

朱丹榮，盛偉松，孫 玥，劉志峰，季國忠，李 楠

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒童內(nèi)鏡中心 210003；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科消化 210004；3.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化醫(yī)學(xué)中心 210003；4.南京醫(yī)科大學(xué)附屬伊犁哈薩克自治州友誼醫(yī)院兒科消化，新疆 835000)

結(jié)腸息肉為一種兒童消化系統(tǒng)常見疾病，是導(dǎo)致兒童下消化道出血的主要病因[1]。絕大部分為良性病變，但也有文獻(xiàn)報道導(dǎo)致惡變可能[2]。兒童腸息肉會導(dǎo)致免疫力降低，貧血，甚至可引起外科急腹癥如腸套疊等。當(dāng)前文獻(xiàn)對于兒童腸息肉的病理和治療報道較多，但對其發(fā)病機制暫無明確報道[3]。KELLEHER等[4]認(rèn)為結(jié)直腸息肉的產(chǎn)生與基因變化有關(guān)。目前，腸鏡仍是診治兒童腸息肉的“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]，但由于腸鏡是一種侵入性操作，且需要麻醉的配合，患兒家長的顧慮使腸鏡的廣泛和及時應(yīng)用受到一定限制，因此很多時候兒童腸息肉并不能得到最及時的診治。

隨著現(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué)的快速發(fā)展，人們在分子水平上對許多疾病的發(fā)生、發(fā)展及其相關(guān)機制展開了研究，催生出許多疾病的分子靶向治療的新興理念，這一領(lǐng)域的進(jìn)步使得許多疾病的診治手段增加，且療效得到提升[6]。所以，在分子水平層面深入研究兒童腸息肉發(fā)生、發(fā)展的作用機制，找出其特異性的特征性分子可能為兒童腸息肉的臨床診治提供新的方向和方法。

本研究采集兒童腸息肉組織及正常腸黏膜組織(息肉病理檢查證實為幼年性息肉)，因兒童的特殊性及實驗經(jīng)費的限制，以3例配對正常腸黏膜和腸息肉，外加4例兒童腸息肉(共7例息肉)開展了兒童腸息肉組織的長非編碼RNA(lncRNA)測序研究，隨后分別在60例兒童腸息肉組織及配對的正常腸黏膜組織標(biāo)本中運用RT-qPCR驗證了6個差異表達(dá)lncRNA基因。

1 材料與方法

1.1材料來源

選取3例配對正常腸黏膜和腸息肉，外加4例兒童腸息肉，共7例腸息肉，所有標(biāo)本均獲取患兒的家屬書面同意并且通過南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2018KY087)。兒童腸息肉組織及正常腸黏膜組織均來自診斷為兒童腸息肉的患兒并經(jīng)病理檢查證實為幼年性息肉。兒童腸息肉組織標(biāo)本來自離體腸息肉組織，正常腸黏膜組織標(biāo)本取自正常腸管組織或離息肉5 cm以上腸組織。本研究獲得研究對象的家屬的知情并同意參與。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本處理

病理診斷為幼年性息肉的患兒在腸鏡檢查中收集所需標(biāo)本，息肉標(biāo)本取材黃豆粒大小，正常腸黏膜組織采取活檢鉗夾取3塊組織，用磷酸鹽緩沖液洗3次，登記編號，將編號后的樣品分別置于液氮中低溫保存。整個采集及處理時間均為自標(biāo)本組織離體10 min內(nèi)(Xirou3編號因質(zhì)檢原因舍去)。

1.2.2資料收集

收集樣本的編號、來源部位、年齡、性別、體重指數(shù)(BMI)等基本資料，見表1。腸息肉和正常腸黏膜樣本性別、年齡、BMI比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 基本資料

表2 兩組樣本一般資料比較

1.2.3總RNA提取

RNA 的抽提使用AMBION試劑盒(試劑貨號AM1561，試劑批號1409128)。

1.2.3.1制備組織勻漿

取2 mL離心管(附帶螺旋蓋子)，將研磨珠(直徑1 mm)放入離心管，位置放至離心管1 mL處。將實驗標(biāo)本組織切成小塊置入2 mL離心管中(帶研磨珠)，加入TRIzol試劑(即用型細(xì)胞和組織總RNA提取試劑)直到離心管頂部。旋轉(zhuǎn)擰緊離心管螺旋蓋，仔細(xì)檢查螺旋蓋和離心管結(jié)合部，保證沒有研磨珠夾雜其中，用密封圈密封離心管的管口以便能盡可能減少制備組織勻漿過程中氣體溶膠的生成。于均質(zhì)器內(nèi)對稱的置入離心管后蓋上均質(zhì)器上蓋，機器運行3 min。

1.2.3.2相位分離

完成制備標(biāo)本組織勻漿后樣品在15～30 ℃環(huán)境中孵育5 min以便保證核蛋白復(fù)合體充分裂解。然后將氯仿(與Trizol比例為5∶1)注入離心管中，與Trizol試劑的比例為5∶1，充分搖勻，孵育3 min，放入離心管中進(jìn)行離心，溫度選擇4 ℃，時間為12～15 min。

1.2.3.3RNA沉淀

轉(zhuǎn)移含有標(biāo)本RNA的上層無色液體至新的離心管中，首先沉淀標(biāo)本RNA，然后加入異丙醇試劑。Trizol試劑和異丙醇試劑按照2∶1的比例配置，加入完成以后相同的溫度條件以12 000 r/min離心12～15 min，棄上清液。

1.2.3.4RNA清洗

以75%乙醇沖洗RNA沉淀，配置乙醇與Trizol試劑，比例1.5∶1.0，以7 500 r/min離心4～5 min。

1.2.3.5RNA再溶解

取70 μL的去RNase液，風(fēng)干RNA沉淀物10 min，將沉淀物放入去RNase液中。用微量加樣器反復(fù)抽吸吹打，最后標(biāo)本RNA孵育10 min，溫度為50 ℃。

1.2.4總RNA的純化和RNA質(zhì)檢

使用QIAGEN RNeasy@Mini Kit 純化樣品總RNA。利用Agilent Bioanalyzer 2100檢測RNA完整性。采用Thermo Scientific 生產(chǎn)的NnaoDrop ND-2000檢測，具體操作步驟：(1)開機運行NnaoDrop ND-2000(Thermo Scientific)超微量分光光度計，清潔NnaoDrop ND-2000檢測頭和檢測孔(用潔凈擦鏡紙)，反復(fù)用超純水滴滴入檢測孔，對合檢測頭檢測孔；(2)吸出超純水(作為空白對照組)，用微量加樣器吸取1 μL RNA樣本溶液，留置于檢測孔，點擊“測量”鍵，讀取RNA樣本的吸光度值。

1.2.5cDNA的構(gòu)建

(1)配置反應(yīng)溶液，200 ng總RNA(5 ng polyA+RNA)2.5 μL，Spike Mix 2 μL，隨機引物0.8 μL，總量為5.3 μL。(2)將反應(yīng)溶液按要求配置好，在65 ℃的環(huán)境下靜置10 min，隨后冰浴5 min，將5×First緩沖液預(yù)熱5 min(80 ℃)。(3)配置cDNA合成體系。(4)PCR，40 ℃ 2 min，70 ℃ 15 min，冰浴5 min。

1.2.6高通量測序

測序工作由上海美吉生物有限公司完成。

1.2.7RT-qPCR

每個RT-qPCR(20 μL)體系中含2×qPCR Master Mix 10 μL，正向引物(10 μmol/L)0.2 μL，反向引物(10 μmol/L)0.2 μL，cDNA 2 μL，ROX染料0.4 μL，以及ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：擴(kuò)增曲線95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s；熔解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔCt法，計算目的基因相對表達(dá)量，引物序列見表3。

1.2.8生物信息學(xué)分析

采用David數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體(GO)分析，用京都基因與基因線百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Pathway分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1相關(guān)分析、聚類熱及火山

樣本間均無顯著相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩組樣本直接基因表達(dá)量存在顯著差異，有多個差異基因顯著上調(diào)或下調(diào)，見圖1。

表3 引物序列

A:聚類熱圖；B:火山圖。

2.2GO及KEGG分析

差異基因主要富集在信號傳導(dǎo)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及癌癥等相關(guān)通路上。

2.3差異表達(dá)的lncRNAs驗證

測序發(fā)現(xiàn)存在1 307+738條差異表達(dá)的mRNA，共598條明顯表達(dá)差異的lncRNA，其中上調(diào)472條，下調(diào)126條。RT-qPCR驗證了MIR4435-2HG、SH3PXD2A-AS1、Lnc00668、MIR194-2HG、AC245060.6、BX890604.2等共6個基因。查閱文獻(xiàn)挑選出3條在腸息肉組織中表達(dá)上調(diào)的，且3條在腸息肉組織表達(dá)下調(diào)的lncRNAs分布為MIR4435-2HG、SH3PXD2A-AS1、LINC00668、MIR194-2HG、AC245060.6、BX890604.2，6條lncRNAs篩選標(biāo)準(zhǔn)為:(1)差異表達(dá)倍數(shù)>2,(2)P<0.05,(3)已知基因名(gene symbol)的lncRNA，(4)生物學(xué)信息軟件預(yù)測有順式作用(Cis)調(diào)控的靶基因。應(yīng)用RT-qPCR方法進(jìn)行驗證，兩組標(biāo)本各基因相對表達(dá)量比較見表4、圖2。

表4 兩組標(biāo)本中差異表達(dá)的lncRNAs比較

3 討 論

隨著基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的迅速發(fā)展發(fā)現(xiàn)只有不足2%左右的基因具有編碼功能，大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄出來的產(chǎn)物是非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)[7]。當(dāng)前l(fā)ncRNA的發(fā)現(xiàn)主要來源于微陣列技術(shù)、第2代高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)、單細(xì)胞測序技術(shù)等。如今，隨著大型lncRNA文庫的建立，以及新一代高通量測序技術(shù)的全方位應(yīng)用和芯片技術(shù)的改良發(fā)展，必將繼續(xù)有大量lncRNA被篩選鑒定出來[8]。

隨著研究的深入，越來越多的數(shù)據(jù)表明，人類許多疾病的發(fā)生、發(fā)展均與lncRNA表達(dá)異常密切相關(guān)，如lncRNA在許多惡性腫瘤中的表達(dá)都與在正常組織中有很大差異。肺腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1是第一個在肺癌中被研究的lncRNA,其在肺癌中具有很高的表達(dá)特異性，被認(rèn)為是非小細(xì)胞肺癌，尤其是肺腺癌早期轉(zhuǎn)移階段的特異性標(biāo)志物[9]。據(jù)文獻(xiàn)報道，胃癌中存在許多上調(diào)的異常表達(dá)的lncRNA，如CCAT1、HULC、H19等[10]，YARANI等[11]在一項克羅恩病(CD)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)及正常結(jié)腸對照組織中的測序發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較，CDKN2B-AS1 lncRNA在CD患者中表達(dá)下調(diào)了4.9倍(P=0.041)，而在UC中下調(diào)了12倍(P=0.000 9)。這項發(fā)現(xiàn)在其他研究中也得到了證實[12]。有學(xué)者通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者全血中鋅指結(jié)構(gòu)反義轉(zhuǎn)錄本1水平(0.74±0.07)顯著低于非心肌梗死患者和健康志愿者，故將其稱為心臟特異性或心臟相關(guān)的lncRNA[13]。

目前，尚未見lncRNA與兒童腸息肉的文獻(xiàn)報道，本研究利用高通量測序技術(shù)對3對兒童腸息肉組織及配對的正常腸黏膜組織，加4例兒童腸息肉，共計10例標(biāo)本進(jìn)行檢測和生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了1 307+738條差異表達(dá)的mRNA(腸息肉組織和正常腸黏膜組織差異表達(dá)2倍以上)，而lncRNA差異表達(dá)明顯者598條，其中上調(diào)472條，下調(diào)126條。進(jìn)一步篩選出在每個樣本中均有表達(dá)且差異最明顯的lncRNA,為此挑選了MIR4435-2HG、SH3PXD2A-AS1、LINC00668、MIR194-2HG、AC245060.6、BX890604.2進(jìn)行驗證，結(jié)果表明測序結(jié)果準(zhǔn)確，為后續(xù)研究lncRNA在兒童腸息肉中的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。GO和KEGG分析提示差異表達(dá)的lncRNA主要涉及信號傳導(dǎo)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及癌癥等相關(guān)過程，提示其可能與兒童腸息肉的生物特征有關(guān)。

lncRNA——MIR4435-2HG也稱為AK001796和lnc00978，編碼在人類染色體2Q13上。作為一種癌基因，MIR4435-2HG最初的特征是參與了肺癌細(xì)胞生長抑制[14]。隨后研究發(fā)現(xiàn)MIR4435-2HG的表達(dá)與乳腺癌患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)[15]。另一方面，最近研究表明MIR4435-2HG可促進(jìn)胃癌(Gastric Cancer,GC)生長，并提示其可作為GC診斷標(biāo)記物的相關(guān)性[16-17]。作者已在體外實驗中對于lncRNA MIR4435-2HG進(jìn)行了相關(guān)細(xì)胞株的進(jìn)一步研究。

SH3PXD2A-AS1在大腸癌中發(fā)揮致癌作用已有文獻(xiàn)報道[18]，但對其在大腸癌中的作用和機制研究的文獻(xiàn)報道甚少見。因此，GUO等[19]研究了SH3PXD2A-AS1對大腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡以及腫瘤生長的影響，其利用miRDB和miRTarBase數(shù)據(jù)庫篩選出miR-330-5p和UBA2，構(gòu)建了SH3PXD2A-AS1/miR-330-5p/UBA2 CERNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并檢測了SH3PXD2A-AS1/miR-330-5p/UBA2網(wǎng)絡(luò)在大腸癌細(xì)胞生長和存活中的作用，認(rèn)為SH3PXD2A-AS1可作為大腸癌治療的潛在生物標(biāo)志物。

已有研究證明lnc00668是幾種癌癥的致癌基因，如非小細(xì)胞肺癌[20]和胃癌[21]。 此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)lnc00668在腫瘤組織樣品和癌細(xì)胞系中顯著升高，lnc00668通過與miR-532-5p結(jié)合促進(jìn)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生[22]。

最新的高通量測序的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，lncRNA——MIR194-2HG在膀胱癌中被下調(diào)[23]。XU等[24]評估了在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中不經(jīng)常研究的lncRNA——MIR194-2HG的表達(dá)，并研究了其作用和分子機制。認(rèn)為MIR194-2HG通過激活Wnt/β-聯(lián)蛋白信號通路在HepG2和Huh7細(xì)胞中發(fā)揮致癌作用。此外，其還證明了MIR194-2HG與miR-1207-5p/TCF19軸相互作用，從而消除了miR-1207-5p對TCF19的抑制作用，表明MIR194-2HG可能是肝癌的新型診斷標(biāo)記物或治療靶標(biāo)。

本研究的局限性是由于兒童的特殊性，初始所得測序樣本量較小，存在一定的研究偏倚，數(shù)據(jù)只能作為初步參考，后期將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。但本研究所揭示的lncRNA在兒童腸息肉中的差異表達(dá)可能為兒童腸息肉的發(fā)病機制研究帶來新的思路，并可能為疾病診治提供新的線索和潛在的干預(yù)靶標(biāo)。