IGF2BP2調控食管癌細胞增殖和凋亡相關基因可變剪接的機制研究*

馮靜芳，唐 勇，馬蘭英，李凡周，韓 梅

(新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院消化內科，烏魯木齊 830011)

食管癌惡性程度高、預后差，是全球惡性腫瘤相關死亡的第6位主要原因。盡管食管癌的診治水平較前有所進步，但其5年生存率仍停留在較低水平[1]。胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白2(IGF2BP2)也稱為IMP2/VICKZ2。廣泛表達于人體多種組織器官，參與胰腺生長、發(fā)育并有刺激胰島素分泌的作用[2]。有研究表明，在食管腺癌或鱗癌患者中，IGF2BP2 表達與短生存期相關,IGF2BP2 可能是Barrett食管和食管腺癌的一個有用的預后標記物[3]。IGF2BP2 rs1470579 A>C多態(tài)性與食管胃交界腺癌風險降低相關[4]。然而，IGF2BP2 在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制目前尚罕見文獻報道。

本研究對人食管癌細胞系ECA109中IGF2BP2 進行過表達，并進行轉錄組測序，通過數(shù)據(jù)分析在全基因組范圍內尋找IGF2BP2 調控的差異表達基因(DEG)和可變剪接基因，探討了IGF2BP2在食管癌中的作用機制，旨在為食管癌的診治提供新的思路與臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對象

在人食管癌細胞系ECA109中對IGF2BP2 進行過表達，并進行轉錄組測序。

1.2方法

1.2.1細胞學實驗

1.2.1.1克隆和質粒構建

使用 CE Design V1.04設計Hot Fusion 的引物對。每個引物都包含基因特異性序列片段和 pIRES-hrGFP-1a 載體的17～30 bp序列。正向引物:agc ccg ggc gga tcc gaa ttc ATG ATG AAC AAG CTT TAC ATC G；反向引物:gtc atc cttg tag tcc tcg ag CTT GCT GCG CTG TGA GGC。pIRES-hrGFP-1a載體經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ(NEB)37 ℃消化2～3 h。用Trizol從HeLa細胞中分離總 RNA。通過寡聚dT引物將純化的RNA轉錄為 cDNA，然后通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增合成插入片段，通過化學轉化將質粒引入大腸桿菌菌株中。

1.2.1.2細胞培養(yǎng)、轉染與分組

ECA-109 細胞(中國普賽爾生命科技有限公司)在含有 10% 胎牛血清、100 μg/mL 鏈霉素、100 U/mL 的RPMI 1640 中于 37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)。使用脂質體2000(英杰，美國加利福尼亞州卡爾斯巴德) 進行ECA-109細胞的質粒轉染。48 h后收獲轉染細胞用于實時熒光定量PCR分析。實驗組為IGF2BP2過表達組，對照組為空載體組。

1.2.1.3基因過表達的評估

將3-磷酸甘油醛脫氫酶用作評估IGF2BP2過表達效果的對照基因。cDNA合成通過標準程序完成，實時熒光定量qPCR在Bio-Rad S1000上用Bestar SYBR Green 實時熒光定量PCR預混液(DBI生物科學公司，上海)進行。然后使用2-ΔΔCT法將每個轉錄本的濃度標準化為磷酸甘油醛脫氫酶mRNA水平。通過使用 GraphPad Prism軟件(加利福尼亞州圣地亞哥)與配對t檢驗進行比較。

1.2.2分子實驗

1.2.2.1RNA的提取和測序

總RNA用RQ1脫氧核糖核酸酶處理以去除 DNA。對于每個樣品，1 μg總RNA用于通過Illumina?平臺的 KAPA Stranded mRNA-Seq試劑盒 (#KK8541) 制備 RNA-Seq文庫。

1.2.2.2RNA-Seq原始數(shù)據(jù)的清理和比對

使用FASTX-工具包(0.0.13版)從原始測序讀數(shù)中修剪接頭和低質量堿基。唯一映射的讀數(shù)用于基因讀數(shù)計數(shù)和FPKM計算(每百萬個映射片段的每千堿基轉錄物的片段)。

1.2.2.3DEG分析

使用R Bioconductor package edgeR篩選DEG。

1.2.2.4可變剪接分析

樣品之間的可變剪接事件和受調控的可變剪接事件使用ABLas進行定義和量化。ABLas 檢測10種類型的 ASE 是基于剪接點讀數(shù)，包括外顯子跳躍(ES)、可變的 5′剪接位點(A5SS)、可變的3′剪接位點(A3SS)等。為了評估 RBP 調節(jié)的ASE，進行了t檢驗以評估可變剪接(AS)事件比率變化的顯著性。

1.2.2.5DEG和AS事件的實時熒光定量PCR驗證

從 RNA-Seq文庫制備中剩余的總RNA用于實時熒光定量PCR分析。使用M-MLV逆轉錄酶將 RNA 逆轉錄為cDNA。使用SYBR Green PCR試劑盒(Yeasen)，StepOne實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行實時PCR。所有基因的 RNA 表達水平都針對 GAPDH 的表達水平進行標準化。同時進行實時熒光定量PCR 檢測以進行ASE驗證。

1.2.2.6功能富集度分析

使用KOBAS2.0服務器識別基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路。超幾何測試和本杰米尼-霍赫伯格羅斯?？刂瞥绦蛴糜诙x每個術語的豐富程度。

1.3統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1GF2BP2對基因表達水平的調控作用

IGF2BP2過表達后實驗組IGF2BP2表達顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖1A；RNA-Seq檢測也表明實驗組IGF2BP2表達(FPKM)顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖1B。即實時熒光定量PCR和RNA-Seq兩種方法都表明過表達效果顯著。聚類分析發(fā)現(xiàn)過表達和對照組可以明顯分開，見圖1C。同時其所調控的DEG較少(共 158 個)，其中上調基因81個，下調基因77個(FC ≥ 2 or ≤ 0.5，P<0.01)，見圖1D～E。對 IGF2BP2 過表達后顯著上調、下調的基因進行GO分析均未發(fā)現(xiàn)所富集的信號通路。即在ECA109細胞中IGF2BP2通過轉錄調控下游靶基因的方式不明顯。

A：實時熒光定量PCR定量IGF2BP2表達；B：通過RNA-Seq數(shù)據(jù)量化的IGF2BP2表達；C：通過主成分分析進行聚類分析；D：IGF2BP2調控基因的鑒定；E：對照和IGF2BP2 過表達樣品中 DEG 的分層聚類；FPKM 值是 log2 轉換的，然后每個基因以中值為中心；a： P<0.001；在火山圖中，上調基因用紅色標記，下調基因用藍色標記。

2.2IGF2BP2調節(jié)數(shù)百個基因的選擇性剪接

IGF2BP2調控的可變剪接事件的分類，見表1，圖2A。對各樣本中發(fā)生差異可變剪接的基因(RASG)和DEG進行整合分析，得到表達水平和可變剪接水平都發(fā)生顯著差異的基因共4個，見圖2B。IGF2BP2過表達可變剪接水平發(fā)生顯著變化的基因，在GO分析中富集到糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定生物合成過程、蛋白質穩(wěn)定性調節(jié)、翻譯后的蛋白質修飾、DNA 修復、有絲分裂、基因表達、凋亡過程的正向調控、蛋白c端脂肪化作用、核轉錄mRNA聚(A)尾縮短、細胞增殖等信號通路，其中與食管癌明顯相關的是細胞增殖和細胞凋亡過程，見圖2C。IGF2BP2 過表達后可變剪接水平發(fā)生顯著變化的基因，在 KEGG 分析中富集到代謝途徑、賴氨酸退化、嘧啶代謝、類固醇生物合成、GPI錨的生物合成、葉酸生物合成、細胞周期、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路、煙酸和煙酰胺代謝、甘油磷脂新陳代謝等信號通路，見圖2D。

表1 差異可變剪接事件統(tǒng)計

A：IGF2BP2調控的可變剪接事件的分類；B：IGF2BP2調控的DEG和RASG之間的重疊分析；C：IGF2BP2的前10個富集GO生物過程調節(jié)交替剪接基因；D：IGF2BP2 的前10條富集KEGG通路調節(jié)交替剪接基因。

2.3在細胞增殖和凋亡中具有豐富意義的選擇性剪接基因

IGF2BP2過表達后21個在細胞增殖方面可變剪接的基因，包括ADAMTSL4、TRIO、PLEKHG2、RBCK1、非受體酪氨酸激酶(ABL1)、FAM162A、ITSN1、ARHGAP4、tnfrsf12a等。其中IGF2BP2調控ADMTSL4基因的可變剪接，IGV-sashimi圖顯示A3SS事件，見圖3A。IGF2BP2調控基因TRIO的可變剪接，見圖3B；IGV-顯示ES事件的生魚片圖。IGF2BP2調節(jié)基因ABL1、TNFRSF12A、FAM162A、ITSN1、PLEKHG2、RBCK1和的可變剪接，見圖3C。

A：IGF2BP2 調控 ADMTSL4 基因的可變剪接，IGV-sashimi plot圖顯示了一個A3SS事件；B：IGF2BP2 調節(jié)基因 TRIO 的可變剪接，IGV-sashimiplot 顯示ES 事件；C：IGF2BP2 調節(jié)基因 ABL1、TNFRSF12A、FAM162A、ITSN1、PLEKHG2、RBCK1、TNFRSF12A 的可變剪接。

尋找在細胞凋亡中具有豐富意義的可變剪接基因發(fā)現(xiàn)23個在IGF2BP2過表達后調控細胞凋亡的可變剪接基因，包括細胞周期蛋白依賴性激酶11B(CDK11B)、制瘤素M的細胞因子受體(OSMR)、MRE11A、母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶(MELK)、FTSJ2等。其中IGF2BP2調控基因CDK11B的可變剪接，IGV-生魚片圖顯示A5SS和ES事件，見圖4A。IGF2BP2調控基因MRE11A的可變剪接，IGV-sashimi plot圖顯示A5SS事件，見圖4B。 IGF2BP2調控基因FTSJ2、MELK、OSMR的可變剪接，見圖4C。

A：IGF2BP2調控基因CDK11B的可變剪接，IGV-sashimi plot圖顯示A5SS和 ES 事件；B：IGF2BP2調節(jié)基因MRE11A的可變剪接，IGV-sashimi plot圖顯示A5SS事件；C：IGF2BP2調節(jié)基因FTSJ2、MELK、OSMR 的可變剪接；在A和B中，每個可變剪接事件的讀數(shù)分布繪制在左側面板中，每個基因的轉錄本如下所示：示意圖描繪了ASE、AS1(紫線)和 AS2(綠線)的結構；組成型外顯子序列用黑框表示，內含子序列用水平線表示(右圖，頂部)，而替代外顯子用紅色框表示，內含子用紫色框表示；ASE的RNA-Seq定量和實時熒光定量PCR驗證顯示在右側面板的底部；a：P<0.05。

3 討 論

本研究通過RNA-Seq獲得了人類食管癌細胞系ECA109中IGF2BP2調控的轉錄組。比較轉錄組分析顯示，IGF2BP2過表達導致ECA109細胞中158個基因發(fā)生顯著差異表達，其中81個上調，77個下調。然后，對 IGF2BP2 過表達后顯著上調表達的基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)沒有所富集的信號通路，其原因可能是 IGF2BP2過表達上調的基因較少，無法富集到相關的功能通路。對 IGF2BP2 過表達后顯著下調的基因進行 GO 分析也沒有發(fā)現(xiàn)所富集的信號通路，其原因與上調類似，可能是 IGF2BP2 過表達下調的基因較少，無法富集到相關的功能通路。因此，在食管癌中IGF2BP2 通過調控DEG的方式影響食管癌的發(fā)生、發(fā)展，可能并不顯著。另外，IGF2BP2過表達造成997個差異可變剪接事件的發(fā)生，在 GO 分析中富集到凋亡過程的正向調控，細胞增殖與食管癌相關。在KEGG分析中同樣富集到細胞凋亡及增殖與食管癌相關。提示IGF2BP2通過調控基因的可變剪接，繼而參與以上生物過程的發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)支持了IGF2BP2 作為潛在的食管癌促癌因子可能通過細胞增殖、凋亡相關通路中的基因的可變剪接促進食管癌的發(fā)生、發(fā)展，進一步擴展了對其作為臨床治療靶標的作用機制的認識。

在IGF2BP2調控的可變剪接事件中，在細胞增殖功能通路中發(fā)現(xiàn)ADAMTSL4、TRIO、PLEKHG2、RBCK1、ABL1、FAM162A、ITSN1、TNFRSF12A的可變剪接發(fā)生了顯著變化。有研究表明，ADAMTSL4作為細胞外基質相關特征的基因，通過其表達和免疫功能分析發(fā)現(xiàn)這種 ECM 相關的特征基因可能在腫瘤微環(huán)境的變化中發(fā)揮著重要作用，可能作為獨立的預后因素，并為食管鱗癌(ESCC)患者的化療反應提供潛在的生物標志物[5]。TRIO基因位于染色體5p擴增區(qū)，其基因融合已經(jīng)在4種不同的肉瘤組織類型中被識別出來，可能意味著與腫瘤進展有關的次生事件有關[6]。ABL1被認為是ESCC的預測和預后因素，可以反映腫瘤微環(huán)境中的免疫紊亂并獨立區(qū)分生存率降低的高風險患者，為ESCC患者提供新的預測和治療靶點[7]。其還可與上述的另一基因PLEKHG2，一種Rho特異性鳥嘌呤核苷酸交換因子，相互作用通過核因子-κB 信號通路通過細胞內蛋白質積累抑制細胞生長[8]。已有研究表明，TNFRSF12A是一種可行的預后生物標志物，也是膠質瘤的潛在免疫治療靶點，其表達水平也與乳腺癌、甲狀腺癌等患者的預后相關，但目前暫無與食管癌直接的相關研究[9-11]。上述基因均已證實與食管癌，抑或腫瘤的發(fā)生等相關，與本研究結果類似，但其具體作用是否與IGF2BP2過表達后所致基因在細胞增殖方面的可變剪接有關尚有待于進一步研究。而RBCK1、FAM162A、ITSN1基因在食管癌及其他惡性腫瘤中的研究目前尚未見文獻報道，但可能通過其可變剪接參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展，尚有待于進一步研究驗證。

在IGF2BP2調控的可變剪接事件中，在細胞凋亡功能通路中發(fā)現(xiàn)CDK11B、OSMR、MRE11A、MELK、FTSJ2的可變剪接發(fā)生了顯著變化。有研究表明，減數(shù)分裂重組11同源物與ESCC 腫瘤耐藥的異常機制相關。抑制 MRE11A 表達與 ESCC 細胞系中的順鉑耐藥性相關。MRE11A可以作為新輔助化療(NAC)反應的預測因子和 ESCC 患者的預后標志物[12]。MELK是 ESCC 患者的潛在治療靶點，在 ESCC 細胞系和人類樣本中觀察到 MELK 的高表達，尤其是在轉移性腫瘤組織中。MELK過表達促進了ESCC細胞增殖、集落形成、遷移和侵襲，MELK的增強表達大大加速了體內ESCC細胞的腫瘤生長和肺轉移[13]。FTSJ2是一種熱休克誘導的線粒體蛋白，對癌細胞的侵襲和遷移具有抑制作用[14]。也有文獻報道稱FTSJ2可以降低了非小細胞癌細胞的侵襲性，可能是非小細胞癌患者治療反應的預測性生物標志物[15]。OSMR被認為與多種癌癥相關。如OSMR被確定為具有較高表達水平、顯著預后價值和優(yōu)良診斷效率的胰腺癌關鍵基因[16]。另一研究指出OSMR調節(jié)腦腫瘤干細胞增殖和膠質母細胞瘤的發(fā)生，抑制OSMR可改善膠質母細胞瘤對電離輻射的反應并延長壽命[17]。但目前沒有相關文獻報道其在食管癌中的作用機制，包括CDK11B，也暫未見其與食管癌相關性的文獻報道，然而有文獻報道稱其在肝細胞癌 (HCC) 的生物學中起著至關重要的作用，CDK11B可促進HCC干細胞的自我更新，敲除CDK11B可以減弱HCC干細胞的自我更新能力及其體內致癌性[18]。雖然前述研究已證明CDK11B、OSMR、MRE11A、MELK、FTSJ2基因在腫瘤等疾病中的作用，其中不乏與食管癌發(fā)生、發(fā)展相關的基因，通過本研究，進一步證明了其與食管癌的關系，即可能是發(fā)生在IGF2BP2過表達后調控細胞凋亡的可變剪接基礎之上。

綜上所述，本研究通過在人食管癌細胞系ECA109細胞中對IGF2BP2進行過表達發(fā)現(xiàn)IGF2BP2過表達造成997個差異可變剪接事件的發(fā)生，經(jīng)過GO和KEGG分析富集到細胞增殖和凋亡功能通路。IGF2BP2可能通過調控細胞增殖和凋亡相關基因可變剪接的方式從而在食管癌中發(fā)揮作用。在后期的研究中將繼續(xù)對IGF2BP2調控的可變剪接事件進行驗證，以期為食管癌診治及分子標記物的研究提供更多的理論依據(jù)。