生長(zhǎng)阻滯特異性蛋白6表達(dá)與胎兒生長(zhǎng)受限的相關(guān)性分析*

張奕梅，覃嘉怡，宋鵬書，潘平山

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科，南寧 530003)

胎兒生長(zhǎng)受限(FGR)是指子宮內(nèi)生長(zhǎng)的胎兒的大小和重量減少，其發(fā)生率為所有妊娠的5%～10%。與正常發(fā)育的胎兒相比，F(xiàn)GR胎兒的圍生期死亡率至少增加了10倍[1]。FGR是產(chǎn)科常見(jiàn)并發(fā)癥之一，不僅出生時(shí)FGR嬰兒有更高的胎兒窒息和神經(jīng)發(fā)育障礙的風(fēng)險(xiǎn)，而且兒童期及青春期體能和智能發(fā)育均受影響，成人后更易發(fā)生代謝綜合征[2]。FGR的成因大致可分為三大類：母體因素、胎兒因素和胎盤因素。胎盤因素是FGR最常見(jiàn)的病因之一，但其潛在機(jī)制尚不清楚[3]。 生長(zhǎng)阻滯特異性蛋白6(Gas6)可表達(dá)于胎盤組織、內(nèi)皮細(xì)胞等，是促進(jìn)血管生成的因子。有研究發(fā)現(xiàn)Gas6可增強(qiáng)血小板脫顆粒，促進(jìn)血小板聚集功能，從而介導(dǎo)血栓的形成，Gas6上調(diào)組織因子的表達(dá)，啟動(dòng)凝血過(guò)程[4]。

現(xiàn)臨床有關(guān)胎盤Gas6水平檢測(cè)在FGR患者產(chǎn)前診斷中的作用研究尚不多見(jiàn)，鑒于此，本研究通過(guò)探討FGR患者胎盤Gas6的表達(dá)水平，尋找引起FGR的相關(guān)機(jī)制，為指導(dǎo)臨床對(duì)FGR的預(yù)防、診治提供一定的理論與臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2020年6月至2021年6月本院產(chǎn)科診斷為FGR孕婦50例作為試驗(yàn)組，同期選取50例妊娠正常孕婦作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)出生體重低于同孕齡同性別胎兒平均體重兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差或第十百分位數(shù)或孕37周后胎兒出生體重小于2 500 g；(2)胎齡大于或等于28周；(3)自然妊娠且單胎；(4)剖宮產(chǎn)終止妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)過(guò)期妊娠、多胎妊娠或胎兒畸形；(2)合并內(nèi)、外科疾病，如闌尾炎、血液系統(tǒng)性疾病、高血壓、糖尿病等；(3)胎盤腫瘤及胎盤血管瘤；(4)明確臍帶因素導(dǎo)致的FGR；(5)明確胎兒染色體異常導(dǎo)致的FGR。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，兩組孕婦均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1資料采集

收集孕婦社會(huì)人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料(年齡、孕前體重、身高、教育程度、職業(yè)、受孕方式等)和生活習(xí)慣(孕期是否抽煙、飲酒等)。記錄孕前體重指數(shù)(BMI) 、臍血流S/D值和妊娠期并發(fā)癥。待分娩后，從住院病歷系統(tǒng)收集母嬰結(jié)局資料。

1.2.2實(shí)驗(yàn)試劑

Gas6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml060423,ml038196)、多聚甲醛固定液(美國(guó)Sigma公司，P-6148)、Gas6抗體(美國(guó)Abcam公司，ab223738)、TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒(美國(guó)ThermoFisher公司，15596026，4368813，A25742)等。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，見(jiàn)表1。

表1 合成引物

1.2.3胎盤組織病理學(xué)檢查

取胎盤母體面中央約1 cm3組織塊，用生理鹽水漂洗血液，置于4%的多聚甲醛液中固定24 h。然后組織塊脫水，行石蠟包埋，切成4 μm厚度薄片，放入37 ℃溫水表面貼到載玻片上，再依次浸入二甲苯和梯度乙醇脫蠟。蒸餾水沖洗，將載玻片放入蘇木精溶液中染色，流水沖洗，放入37 ℃溫水中進(jìn)行反藍(lán)，晾干，中性樹膠封固保存，顯微鏡觀察HE染色情況。

1.2.4ELISA檢測(cè)外周血Gas6表達(dá)

采集兩組孕婦外周血3 mL，室溫放置1 h 后4 ℃、3 000 r/min 離心 15 min，取上清液，使用對(duì)應(yīng)的試劑盒通過(guò)ELISA檢測(cè)兩組孕婦血清Gas6的表達(dá)情況，所有操作均嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.5免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)胎盤組織中Gas6蛋白的表達(dá)

剪取分娩胎盤母體面約1 cm3組織塊，用PBS沖洗血液，置于4%的多聚甲醛液中固定24 h。然后組織塊脫水，石蠟包埋，切成4 μm厚度薄片貼到載玻片上，再依次經(jīng)過(guò)脫蠟，高壓修復(fù)，3%雙氧水中孵育和封閉。滴加一抗孵育過(guò)夜，二抗孵育20 min，DAB顯色5 min。蘇木素染色1 min，分化反藍(lán)，梯度乙醇脫水，樹膠封片，用電子顯微鏡觀察陽(yáng)性面積大小。

1.2.6qPCR檢測(cè)胎盤組織中Gas6 mRNA的表達(dá)

取分娩胎盤母體面約1 cm3組織塊，用PBS沖洗血液，將組織放在-80 ℃冰箱保存。根據(jù)TRIzol-Reagent試劑盒提取RNA，采用ND2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，參照TaKaRa公司說(shuō)明書進(jìn)行qPCR。反應(yīng)程序設(shè)置為95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸2 min。以GAPDH為內(nèi)參，每次檢測(cè)設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線，得到每個(gè)樣本的循環(huán)周期數(shù)(Cq值)，使用2-△△Ct法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1一般資料

兩組孕婦均無(wú)吸煙/飲酒史。試驗(yàn)組孕婦孕周、新生兒體重均明顯少于對(duì)照組，臍血流S/D值、BMI值、羊水過(guò)少發(fā)生率、妊娠期并發(fā)癥發(fā)生率、胎兒窘迫、急診剖宮產(chǎn)率均明顯大于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組孕婦一般資料比較

2.2胎盤組織病理學(xué)檢查結(jié)果

對(duì)照組胎盤組織內(nèi)部細(xì)胞排列整齊，絨毛組織幾乎無(wú)破損。試驗(yàn)組胎盤組織內(nèi)部出現(xiàn)細(xì)胞溶解，血管有水腫破裂，絨毛間質(zhì)纖維化及纖維蛋白樣壞死，滋養(yǎng)層細(xì)胞腫脹，排列混亂，見(jiàn)圖1。

A:對(duì)照組；B:試驗(yàn)組。

2.3外周血Gas6表達(dá)水平

對(duì)照組孕婦外周血Gas6表達(dá)水平為(9.60±2.52)pg/mL，試驗(yàn)組為(12.55±2.34)pg/mL。試驗(yàn)組孕婦外周血Gas6表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4胎盤組織中Gas6蛋白表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組胎盤組織中Gas6蛋白的棕色陽(yáng)性區(qū)域表達(dá)水平明顯上升，見(jiàn)圖2。

A:對(duì)照組；B:試驗(yàn)組。

2.5胎盤組織中Gas6 mRNA表達(dá)情況

對(duì)照組胎盤組織中Gas6 mRNA的表達(dá)水平為1.03±0.04，試驗(yàn)組為1.41±0.23。試驗(yàn)組胎盤組織中Gas6 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

FGR的發(fā)生是由于胎盤功能的損害，胎兒沒(méi)有達(dá)到其宮內(nèi)生長(zhǎng)和發(fā)育的標(biāo)準(zhǔn)[5]。FGR是圍生期死亡的第二大原因，造成30%的死產(chǎn)嬰兒，也是早產(chǎn)和產(chǎn)時(shí)窒息的最常見(jiàn)原因。美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)院將FGR定義為胎齡低于10%的胎兒體重，并指出其與胎盤循環(huán)障礙有關(guān)[6]。胎盤循環(huán)障礙多與胎盤發(fā)育異常密切相關(guān)，F(xiàn)GR患者的胎盤多存在血管病變、胎盤血液循環(huán)阻力過(guò)高，導(dǎo)致胎盤血液循環(huán)受阻，胎盤血流量降低，引發(fā)嚴(yán)重胎兒缺血、缺氧、死亡的不良結(jié)局[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)FGR患者的胎盤組織內(nèi)部血管破裂溶解，絨毛間質(zhì)纖維化及纖維蛋白樣壞死，滋養(yǎng)層細(xì)胞腫脹，排列混亂，說(shuō)明FGR患者的胎盤組織中血管壓力過(guò)大導(dǎo)致組織損傷出現(xiàn)纖維化狀態(tài)。纖維化是由于重復(fù)的組織損傷和修復(fù)過(guò)程失調(diào)而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的結(jié)果。Gas6基因是一種維生素k依賴的生長(zhǎng)因子，表達(dá)于許多細(xì)胞類型，包括血管平滑肌細(xì)胞、系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[8]。BELLAN等[9]指出Gas6在炎癥控制和纖維化疾病進(jìn)展中扮演了重要角色，推測(cè)Gas6可能成為減少纖維化損傷的潛在治療靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)Gas6也在血小板中表達(dá)，可以加強(qiáng)血小板脫顆粒，促凝聚，促進(jìn)血栓形成[10]。一項(xiàng)Gas6 抗體抑制血小板功能研究表明，Gas6 特異性抗體能有效作用于 Gas6 蛋白結(jié)構(gòu)中負(fù)責(zé)將其與受體結(jié)合的C端，從而抑制血小板的活化[11]。陳宣辰[12]發(fā)現(xiàn)Gas6可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)、腎功能損害、脂肪形成、血管生成以及血栓形成參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展。FGR患者的胎盤多存在血管病變、循環(huán)阻力過(guò)高等問(wèn)題，導(dǎo)致胎盤血液循環(huán)受阻，胎盤血流量降低，導(dǎo)致FGR，隨著胎盤血液循環(huán)阻力的不斷升高，可引發(fā)嚴(yán)重胎兒缺血、缺氧、死亡的不良結(jié)局[13]。為了驗(yàn)證Gas6因子與FGR患者發(fā)病存在相關(guān)性，本研究收集了FGR患者分娩前的外周血和分娩后的胎盤組織，檢測(cè)了Gas6在其中的表達(dá)水平與正常孕婦相應(yīng)表達(dá)水平的差別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gas6分子表達(dá)與FGR存在相關(guān)性，Gas6在FGR患者外周血和胎盤組織中均高表達(dá)，可以初步推斷Gas6分子在FGR發(fā)病和疾病發(fā)展中存在一定的協(xié)同作用。

為了明確FGR癥狀發(fā)生危險(xiǎn)性及其發(fā)生機(jī)制與胎盤組織病理的相關(guān)性，本研究收集了FGR孕婦與健康孕婦的一般資料和妊娠期情況進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，F(xiàn)GR孕婦臍血流S/D值、BMI值均明顯高于健康孕婦，說(shuō)明FGR孕婦機(jī)體本身出現(xiàn)了異樣，如羊水量較少，發(fā)生妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病和嚴(yán)重貧血，這些并發(fā)癥也均與胎盤發(fā)育異常有關(guān)。羊水量的多少反映胎盤的功能，羊水過(guò)少與宮內(nèi)慢性缺氧導(dǎo)致胎兒體內(nèi)的血液重新分布，使得胎兒腎臟血流量下降，所生成的尿液減少有關(guān)[14]。臍血流S/D值增加后外周小動(dòng)脈阻力增加、小動(dòng)脈發(fā)生痙攣，使得胎盤螺旋小動(dòng)脈的血容量減少，引起胎盤缺血、缺氧和灌注不足、胎盤絨毛膜壞死梗阻均會(huì)導(dǎo)致妊娠期高血壓[15]。所以胎盤組織中血管的損傷病變均會(huì)導(dǎo)致胎兒對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣攝入不足而發(fā)生FGR。

目前，已知胎盤及臍帶、胎兒遺傳性疾病等與FGR的發(fā)病密切相關(guān)，但其作用機(jī)制復(fù)雜，與FGR的關(guān)系尚未明確。Gas6有抗血管生成的作用，導(dǎo)致血流供應(yīng)受阻，本研究中FGR孕婦外周血檢測(cè)Gas6表達(dá)水平高于正常孕婦。本研究總結(jié)，Gas6可以與超聲檢測(cè)指標(biāo)、臨床診斷相結(jié)合，發(fā)揮其輔助診斷作用才能有效提高FGR的早期診斷效率。