ECM/SVF-gel對(duì)比Coleman脂肪治療糖尿病大鼠創(chuàng)面的效果與機(jī)制研究

趙文懿，楊中玉，孫曉涵，宋培軍，徐 靜△

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院整形外科，安徽蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院組織移植實(shí)驗(yàn)室，安徽蚌埠 233000)

脂肪來(lái)源干細(xì)胞基質(zhì)膠(ECM/SVF-gel)是一種對(duì)脂肪進(jìn)行簡(jiǎn)單的物理機(jī)械處理后獲得的凝膠狀物質(zhì)，制作過(guò)程中無(wú)外源性物質(zhì)的添加，同時(shí)，含有高濃度的具有生物活性的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和血管基質(zhì)組分(stromal vascular fraction，SVF)[1]?；贑oleman脂肪的制作過(guò)程，ECM/SVF-gel只需在Coleman脂肪的基礎(chǔ)上再進(jìn)行簡(jiǎn)單的破碎和離心即可獲得，其制備過(guò)程中的破碎與離心步驟使脂肪組織中的成熟脂肪細(xì)胞被最大限度地破壞，從而獲得了富含脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adipose derived stem cells，ADSCs)和ECM的混合物質(zhì)[2-3]。已有研究證實(shí)，ECM/SVF-gel可上調(diào)組織中生長(zhǎng)因子——堿性或纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)水平，促進(jìn)大鼠缺血性皮瓣中血管再生[4]。本研究對(duì)ECM/SVF-gel與Coleman脂肪治療糖尿病大鼠創(chuàng)面的療效進(jìn)行了對(duì)比，并對(duì)ECM/SVF-gel的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，旨在為臨床應(yīng)用ECM/SVF-gel治療糖尿病導(dǎo)致的創(chuàng)面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物來(lái)源

糖尿病造模選用14只300～350 g的SD大鼠，雄性，8～9周齡；脂肪供體鼠選用5只350～400 g的SD大鼠，雌性，6～8周齡；實(shí)驗(yàn)用鼠均購(gòu)于山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置均符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑

特級(jí)胎牛血清(FBS)購(gòu)自澳洲CLARK公司，杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)/F12培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；4%多聚甲醛、青霉素-鏈霉素雙抗均購(gòu)自北京Biosharp公司，鏈脲佐菌素(STZ)、檸檬酸、檸檬酸鈉均購(gòu)自上海Yeason公司，4%多聚甲醛、石蠟、中性樹(shù)脂均購(gòu)自北京Solarbio公司；無(wú)水乙醇、二甲苯、水合氯醛均購(gòu)自上海Macklin公司，大鼠表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、bFGF、VEGF和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.1.3儀器及耗材

100、40 μm濾網(wǎng)，0.22 μm濾芯均購(gòu)自美國(guó)Biologix公司，2.4 mm魯爾連接器購(gòu)自黑龍江四海醫(yī)療，10 mL注射器購(gòu)自上海KDL公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)自蚌埠新科凈化設(shè)備廠，手術(shù)器械購(gòu)自河南美邦醫(yī)療器械，石蠟包埋機(jī)購(gòu)自孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器公司，切片機(jī)(RM2245)購(gòu)自德國(guó)LEICA公司，移液槍購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，高速離心機(jī)(Multifuge X1R)、細(xì)胞培養(yǎng)箱均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2方法

1.2.1Coleman脂肪和ECM/SVF-gel的制備

將體重350～400 g的SD大鼠麻醉后脫毛，用聚維酮碘消毒；無(wú)菌手術(shù)器械取大鼠腹股溝處脂肪，用無(wú)菌PBS反復(fù)沖洗，去除血液；移入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，反復(fù)用剪刀剪切脂肪組織約3 min；加入適量無(wú)菌PBS，672 r/min離心3 min，將位于底層的水及結(jié)締組織去除，位于中層的脂肪組織即為所需的Coleman脂肪。離心去水的脂肪組織按密度大小分為高、低密度脂肪組織，位于離心管中上2/3的組織為低密度脂肪組織，位于下1/3的組織為高密度脂肪組織。以?xún)?nèi)徑為2.4 mm的魯爾連接器連接2個(gè)10 mL注射器，將低密度脂肪組織置入，推注速度保持恒定(10 mL/s)，反復(fù)推注約2 min，通過(guò)機(jī)械方式使脂肪乳糜化；推注完成后脂肪呈乳糜狀；將高密度脂肪與推注完成后的低密度脂肪混合均勻，置于以?xún)?nèi)徑為2.4 mm的魯爾連接器連接的2個(gè)10 mL注射器中，再次互相推注約30 s后1 120 r/min離心3 min，可見(jiàn)上層有大量的油，底層則可見(jiàn)有少量的水，以上二者皆棄去，離心管中余下的位于油層之下的凝膠樣物質(zhì)即為所需的ECM/SVF-gel[5-6]，見(jiàn)圖1。

左：Coleman脂肪；右：ECM/SVF-gel；肉眼觀察，與Coleman脂肪比較，ECM/SVF-gel質(zhì)地更加細(xì)膩、光滑。

1.2.2生長(zhǎng)因子的收集

SVF細(xì)胞數(shù)以5×105為基線，準(zhǔn)備相應(yīng)質(zhì)量的ECM/SVF-gel及Coleman脂肪。將計(jì)算好相應(yīng)質(zhì)量的2種不同的脂肪組織制品分別移入T25培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶中各添加5 mL完全培養(yǎng)基(含10% FBS)，將培養(yǎng)瓶置于含有5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。24 h后為獲得條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)以DMEM/F12培養(yǎng)基(無(wú)FBS)將培養(yǎng)瓶中的完全培養(yǎng)基全部替換，培養(yǎng)24 h；24 h后分別收集培養(yǎng)瓶中的上清液，依次通過(guò)100、40 μm濾網(wǎng)，去除細(xì)胞及組織碎片；收集濾液，168 r/min離心5 min，離心后的上清液通過(guò)0.22 μm濾芯過(guò)濾除菌；移入凍存管中，置于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3建立糖尿病大鼠模型

選取體重300～350 g的SD雄性大鼠14只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后禁食不禁飲，12 h后按55 mg/kg一次性腹腔注射1%的STZ溶液。注射1周后檢測(cè)大鼠血糖變化?？崭寡浅^(guò)16.8 mmol/L，發(fā)生多飲、多尿、多食、體重減輕等即可確定為建模成功。

1.2.4建立大鼠創(chuàng)面模型及條件培養(yǎng)基的干預(yù)

取建模成功的糖尿病大鼠(14只)采用戊巴比妥腹腔麻醉，以直徑10 mm的組織活檢器在大鼠背部制作直徑10 mm的全層皮膚缺損創(chuàng)面，每只大鼠2個(gè)創(chuàng)面；預(yù)先制備直徑1 cm的環(huán)形硅膠片置于創(chuàng)面，再使用4-0尼龍線縫合4～6針，以防止創(chuàng)周皮膚在早期便嚴(yán)重皺縮，影響觀察，見(jiàn)圖2。

左：術(shù)后即刻；右：術(shù)后14 d，可見(jiàn)位于右側(cè)的注射ECM/SVF-gel-CM的創(chuàng)面，相比位于左側(cè)的注射Coleman-CM的創(chuàng)面，愈合情況更為良好，已近乎完全愈合。

將14只大鼠分為A組(Coleman-CM)和B組(ECM/SVF-gel-CM)，將每只大鼠背部的2個(gè)創(chuàng)面按隨機(jī)法進(jìn)行隨機(jī)分配，做好標(biāo)記，2個(gè)創(chuàng)面分別注射A組(Coleman-CM)與B組(ECM/SVF-gel-CM)，每個(gè)創(chuàng)面注射100 μL，其中20 μL注射在創(chuàng)面基底，80 μL注射在創(chuàng)面周?chē)?4個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)20 μL)；注射完畢后以無(wú)菌敷貼包裹創(chuàng)面，單籠喂養(yǎng)。術(shù)后連續(xù)2 d給予青霉素皮下注射，預(yù)防感染。

1.2.5觀察指標(biāo)

1.2.5.1大體觀察

對(duì)14只大鼠術(shù)后即刻，3、7 d,以及10只大鼠術(shù)后10、14 d進(jìn)行創(chuàng)面觀察和拍照，對(duì)比觀察創(chuàng)面愈合情況。

1.2.5.2創(chuàng)面愈合率

通過(guò)Image J軟件測(cè)量14只大鼠背部創(chuàng)面術(shù)后即刻，3、7 d,以及10只大鼠術(shù)后10、14 d創(chuàng)面面積，創(chuàng)面愈合率=(創(chuàng)面初始面積-剩余創(chuàng)面面積)/創(chuàng)面初始面積×100%。

1.2.5.3免疫組織化學(xué)染色觀察

術(shù)后7 d隨機(jī)挑選4只大鼠處死，術(shù)后14 d處死剩余10只大鼠，取創(chuàng)面皮膚組織制作切片，進(jìn)行CD34免疫組織化學(xué)染色，鏡下觀察新生血管形成情況，陽(yáng)性染色顯示為棕色，通過(guò)Image J軟件將各組樣本的陽(yáng)性染色結(jié)果進(jìn)行分離，并分析比較各組陽(yáng)性染色比例。

1.2.5.4生長(zhǎng)因子檢測(cè)

按照ELISA試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟，檢測(cè)2種條件培養(yǎng)基(CMs)中的4種生長(zhǎng)因子——EGF、bFGF、VEGF、TGF-β1表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1創(chuàng)面愈合率

B組創(chuàng)面愈合率均明顯高于A組，A組術(shù)后14 d創(chuàng)面愈合率為(82.04±3.84)%，B組創(chuàng)面愈合率則達(dá)到了(95.54±3.57)%，創(chuàng)面基本已全部上皮化。兩組術(shù)后3、7、10、14 d創(chuàng)面愈合率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表1。

圖3 兩組糖尿病鼠的創(chuàng)面各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的代表照片

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組創(chuàng)面愈合率比較

2.2CD34免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

兩組術(shù)后7 d創(chuàng)面內(nèi)均出現(xiàn)了新生血管，B組陽(yáng)性染色比例為19.304%，A組為14.276%，B組新生血管生成較A組多；兩組術(shù)后14 d新生血管數(shù)量均有不同程度增長(zhǎng)，B組陽(yáng)性染色比例為32.726%，A組為26.155%，B組術(shù)后7、14 d新生血管生成均較A組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 創(chuàng)面組織CD34免疫組織化學(xué)染色圖(×20)

2.3生長(zhǎng)因子表達(dá)水平

A組EGF、bFGF、VEGF、TGF-β1表達(dá)水平均低于B組。其中EGF、bFGF、VEGF表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TGF-β1表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 ELISA檢測(cè)2組CMs中生長(zhǎng)因子水平

3 討 論

以Coleman脂肪的制作過(guò)程為基礎(chǔ)，ECM/SVF-gel是在經(jīng)過(guò)后續(xù)的機(jī)械破碎和離心后獲得的含有高度濃縮的、具生物活性且近似于生理狀態(tài)下的ECM、SVF和ADSCs的凝膠狀的可注射材料，相比于含有相同SVF細(xì)胞數(shù)的Coleman脂肪，ECM/SVF-gel中濃縮的ECM(膠原蛋白、纖維蛋白和彈性蛋白等)更多，從而起到了為ADSCs提供適宜生存的微環(huán)境的作用，同時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞行為，促進(jìn)細(xì)胞增殖，激活細(xì)胞的分化潛能，促進(jìn)更多的生長(zhǎng)因子分泌，并免于巨噬細(xì)胞的吞噬[1-3]。

在本研究進(jìn)行ELISA檢測(cè)的4種生長(zhǎng)因子中，EGF可促進(jìn)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增殖；bFGF可促進(jìn)血管生成；VEGF可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖，并促進(jìn)新生血管形成；TGF-β1在促進(jìn)各類(lèi)ECM(如膠原蛋白、纖粘連蛋白等)表達(dá)的同時(shí)，也能夠抑制降解[7-11]。

本研究應(yīng)用的條件培養(yǎng)基(CM)本質(zhì)即為干細(xì)胞的旁分泌產(chǎn)物，其中包括各種生長(zhǎng)因子、免疫因子和外泌體。經(jīng)檢測(cè)上述4種生長(zhǎng)因子在Coleman-CM和ECM/SVF-gel-CM中均有不同程度的表達(dá)，ECM/SVF-gel-CM中EGF、bFGF、VEGF水平均明顯高于Coleman-CM，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證實(shí)了相較于Coleman脂肪，ECM/SVF-gel能分泌更多的生長(zhǎng)因子——EGF、bFGF和VEGF，并以旁分泌的途徑作用于創(chuàng)面；雖然ECM/SVF-gel-CM中TGF-β1水平仍高于Coleman-CM，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造成該生長(zhǎng)因子水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原因可能為檢測(cè)時(shí)樣品在低溫冷凍中儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成了一定數(shù)量的生長(zhǎng)因子失活或是多次檢測(cè)過(guò)程中反復(fù)的冷凍和復(fù)蘇導(dǎo)致樣品中生長(zhǎng)因子的失活[12]。

本研究將等量的2種CM分別注射至糖尿病大鼠背部創(chuàng)面，B組術(shù)后3、7、10、14 d創(chuàng)面愈合率均明顯高于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組術(shù)后14 d，創(chuàng)面愈合率為(82.04±3.84)%，B組創(chuàng)面愈合率則達(dá)到了(95.54±3.57)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，符合ELISA檢測(cè)的結(jié)果。同時(shí)，CD34免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與A組比較，B組術(shù)后7、14 d陽(yáng)性染色結(jié)果更多，即B組新生血管數(shù)量在術(shù)后7、14 d均比A組更多，同樣符合ELISA檢測(cè)的結(jié)果。

綜上所述，與Coleman脂肪比較，ECM/SVF-gel促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合的效果更突出，其作用機(jī)制為通過(guò)旁分泌途徑分泌更高濃度的生長(zhǎng)因子(EGF、bFGF、VEGF等)作用于創(chuàng)面，促進(jìn)創(chuàng)面部位生成新生血管，加速創(chuàng)面愈合；ECM/SVF-gel作為一種經(jīng)機(jī)械破碎、濃縮自Coleman脂肪的制品具有局部注射用于修復(fù)慢性創(chuàng)面的潛力，為今后臨床應(yīng)用ECM/SVF-gel治療各類(lèi)創(chuàng)面，尤其是糖尿病患者肢體創(chuàng)面等難愈性創(chuàng)面提供了新的思路。