耳穴貼壓改善家兔腹部術(shù)后胃腸功能的作用機(jī)制研究

黃惠榕，薛佳璐，余真鈴，余夢(mèng)霞，吳翠娟，仇志琴

術(shù)后胃腸功能紊亂(Postoperative Gastrointestinal Disorder，PGID)是指術(shù)后患者胃腸內(nèi)容物傳輸延遲，出現(xiàn)不同程度的腹痛、腹脹、惡心、嘔吐及自主排氣排便時(shí)間延長(zhǎng)等癥狀[1]。研究顯示，腹部術(shù)后24 h內(nèi)，胃腸功能紊亂發(fā)生率高達(dá)10%～30%[2]，主要因?yàn)槭中g(shù)對(duì)胃腸器官牽拉、創(chuàng)傷，術(shù)中麻醉及術(shù)后鎮(zhèn)痛藥物的使用，術(shù)后患者禁食、長(zhǎng)期臥床等[3]。若術(shù)后胃腸功能紊亂未及時(shí)處理，可導(dǎo)致腸梗阻、腸粘連、全身炎癥反應(yīng)綜合征等一系列嚴(yán)重并發(fā)癥。目前術(shù)后胃腸功能紊亂發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能與神經(jīng)、體液、肌源性三大調(diào)節(jié)系統(tǒng)失衡有關(guān)[4]。胃腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞是一類在胃腸道發(fā)現(xiàn)的具有產(chǎn)生慢波，調(diào)節(jié)胃腸道節(jié)律性運(yùn)動(dòng)特殊功能的間質(zhì)細(xì)胞[5]，其特異性表達(dá)C-kit蛋白，這是Cajal間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育和功能表現(xiàn)的標(biāo)志[6]。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)僅在應(yīng)激創(chuàng)傷狀態(tài)下表達(dá)在巨噬細(xì)胞上，催化產(chǎn)生大量一氧化氮，通過(guò)影響Cajal細(xì)胞抑制胃腸蠕動(dòng)[7]。耳穴貼壓是指于耳穴處貼上藥豆或磁珠，按壓刺激耳部穴位使其產(chǎn)生酸、麻、脹、熱等感覺(jué)的一種傳統(tǒng)中醫(yī)外治療法[8]。前期本課題組臨床研究發(fā)現(xiàn)，耳穴貼壓應(yīng)用于腹腔鏡術(shù)后患者可縮短患者肛門(mén)排氣時(shí)間，緩解術(shù)后腹脹和患者焦慮，降低術(shù)后應(yīng)激狀態(tài)[9]，但對(duì)其相關(guān)作用機(jī)制尚未闡明。因此，本研究以結(jié)腸吻合術(shù)胃腸功能紊亂家兔模型為研究對(duì)象，運(yùn)用免疫印跡法及免疫組化方法測(cè)量C-kit蛋白陽(yáng)性表達(dá)與iNOS活性，探討Cajal間質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)術(shù)后胃腸運(yùn)動(dòng)紊亂的機(jī)制，為闡明該療法治療術(shù)后胃腸功能紊亂提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康SD清潔型家兔共30只，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu)并飼養(yǎng)[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(閩)2020-0003]，并通過(guò)福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2020048)。嚴(yán)格按照福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)的有關(guān)準(zhǔn)則飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。將30只SD清潔型家兔按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、耳穴組各10只。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備 10%水合氯醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；4%多聚甲醛(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；兔eECL試劑盒(美國(guó)Advansta公司)；兔抗C-kit蛋白陽(yáng)性表達(dá)與iNOS活性，即BCA蛋白試劑盒(HonorGene公司)；離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.3模型制備 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量0.33 mL/100 g。將麻醉好的家兔仰臥位固定于手術(shù)板上，常規(guī)備皮、消毒、鋪無(wú)菌巾，于下腹部正中逐層入腹，切口長(zhǎng)約2 cm，找到家兔盲腸下2 cm處結(jié)腸剪斷，原位縫合后關(guān)腹。手術(shù)過(guò)程中注意保暖，至動(dòng)物清醒后將其放于籠中，單籠飼養(yǎng)。干預(yù)期間定期更換切口敷料，防止感染。手術(shù)當(dāng)天禁食，術(shù)后第1、2天流質(zhì)飲食，將溫開(kāi)水與芝麻糊按6∶1配成70 g。第3天后予固體兔糧喂養(yǎng)，50 g/只至干預(yù)結(jié)束。

1.4干預(yù)方法 ①耳穴組于造模成功后耳穴貼壓胃、大腸、耳中穴。根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]耳穴定位圖中定位方法確定穴位區(qū)域。胃：位于耳輪腳基部周圍區(qū)；耳中穴：位于耳輪腳基部正中；大腸穴：位于耳甲腔內(nèi)側(cè)下1/3。具體操作：術(shù)后經(jīng)穴探測(cè)儀器輔助定穴，取穴后常規(guī)消毒，0.5 cm×0.5 cm無(wú)菌膠布粘貼王不留行籽固定于相應(yīng)穴位，單側(cè)取穴，每3天更換至對(duì)側(cè)耳穴，用示指和拇指按壓，手法由輕到重，3次/d，每次每穴30 s，連續(xù)干預(yù)7 d。②模型組只進(jìn)行造模術(shù)不干預(yù)。③空白組不進(jìn)行任何干預(yù)。

1.5評(píng)價(jià)方法 ①首次排便時(shí)間、術(shù)后腸鳴音恢復(fù)時(shí)間。從腹部手術(shù)后6 h開(kāi)始，1次/2 h觀察并記錄各組術(shù)后首次排便時(shí)間、術(shù)后腸鳴音恢復(fù)時(shí)間。②血清皮質(zhì)醇濃度。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定各組術(shù)后6 h、術(shù)后第3天以及干預(yù)結(jié)束時(shí)的血清皮質(zhì)醇濃度。③小腸推進(jìn)率。使用灌胃注射針抽取2 mL墨水灌胃，30 min后用10%水合氯醛(0.4 mL/kg)腹腔注射，過(guò)量麻醉后處死動(dòng)物，剖開(kāi)腹部暴露胃腸道。直尺測(cè)量小腸全長(zhǎng)及幽門(mén)到墨水前沿推行的距離，推行長(zhǎng)度值除以小腸全長(zhǎng)，得出小腸推進(jìn)率。④實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)。以結(jié)腸吻合口為中央、取1 cm結(jié)腸，用0℃生理鹽水清洗內(nèi)容物?？v向分為2份，分別用于免疫印跡檢測(cè)C-kit蛋白陽(yáng)性表達(dá)和免疫組化測(cè)iNOS活性。免疫印跡法檢測(cè)C-kit蛋白陽(yáng)性表達(dá)方法：提取蛋白；制備電泳凝膠；蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移；蛋白質(zhì)的免疫印跡；蛋白質(zhì)的化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)；灰度分析。免疫組化法檢測(cè)iNOS表達(dá)方法：脫水；石蠟切片；脫蠟；淬滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；抗原修復(fù)；加一抗；加二抗；DAB顯色；復(fù)染細(xì)胞核；脫水封片。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述、t檢驗(yàn)、單因素方差分析及重復(fù)測(cè)量的方差分析，采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組術(shù)后首次排便時(shí)間、腸鳴音恢復(fù)時(shí)間比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組術(shù)后首次排便時(shí)間、腸鳴音恢復(fù)時(shí)間比較

2.2三組術(shù)后不同時(shí)間血清皮質(zhì)醇濃度比較 見(jiàn)表2。

表2 三組術(shù)后不同時(shí)間血清皮質(zhì)醇濃度比較

2.3三組小腸推進(jìn)率比較 見(jiàn)表3。

表3 三組小腸推進(jìn)率比較

2.4三組C-kit蛋白陽(yáng)性表達(dá)及iNOS活性比較 見(jiàn)表4。

表4 三組C-kit蛋白陽(yáng)性表達(dá)及iNOS活性比較

3 討論

3.1耳穴貼壓有助于縮短腹部術(shù)后家兔首次排便時(shí)間與腸鳴音恢復(fù)時(shí)間，提升小腸推進(jìn)率 耳穴貼壓在調(diào)節(jié)術(shù)后胃腸功能中運(yùn)用廣泛。王曉慶等[11]對(duì)耳穴貼壓干預(yù)患者術(shù)后胃腸功能恢復(fù)的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示耳穴貼壓療法可明顯縮短患者術(shù)后排氣時(shí)間、排便時(shí)間，促進(jìn)腸鳴音恢復(fù)，改善腹脹的癥狀。耳穴分布全息律指出：耳廓的陽(yáng)性反應(yīng)點(diǎn)可反映相應(yīng)臟腑的機(jī)能狀態(tài)，當(dāng)某一器官、臟腑功能異常時(shí)，可以通過(guò)刺激相應(yīng)的耳部穴區(qū)來(lái)治療[12]。刺激耳穴胃區(qū)有助于促進(jìn)結(jié)腸平滑肌運(yùn)動(dòng)，改善胃腸蠕動(dòng)[13]。本研究結(jié)果顯示，耳穴組家兔首次排便時(shí)間與腸鳴音恢復(fù)時(shí)間顯著早于模型組，且耳穴組小腸推進(jìn)率顯著高于模型組(均P<0.05)，提示耳穴貼壓對(duì)調(diào)節(jié)腹部術(shù)后家兔的胃腸功能具有積極作用。

3.2耳穴貼壓有助于降低腹部術(shù)后家兔應(yīng)激反應(yīng) 應(yīng)激反應(yīng)是指機(jī)體受到刺激導(dǎo)致交感神經(jīng)-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)興奮，下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)分泌功能活躍，引起機(jī)體各種功能和代謝變化的過(guò)程[14]。血清皮質(zhì)醇是反映應(yīng)激狀態(tài)的敏感指標(biāo)，測(cè)定血清皮質(zhì)醇濃度能有效反映機(jī)體的應(yīng)激水平。本研究對(duì)三組家兔術(shù)后6 h、3 d、7 d的血清皮質(zhì)醇進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示干預(yù)效應(yīng)、時(shí)間效應(yīng)、交互效應(yīng)顯著，術(shù)后6 h、3 d模型組和耳穴組的血清皮質(zhì)醇顯著高于空白組，且術(shù)后3 d時(shí)耳穴組顯著低于模型組(均P<0.05)。反映手術(shù)后家兔處于應(yīng)激狀態(tài)，分泌血清皮質(zhì)醇增多，且耳穴貼壓有助于降低術(shù)后家兔的應(yīng)激反應(yīng)，與魏麗君等[15]的研究結(jié)果一致。術(shù)后7 d三組血清皮質(zhì)醇濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能因?yàn)樾g(shù)后7 d胃腸道功能逐步恢復(fù)，機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)減弱。模型組術(shù)后6 h、3 d、7 d血清皮質(zhì)醇濃度兩兩比較有顯著差異，而耳穴組術(shù)后3～7 d無(wú)顯著差異，反映耳穴貼壓能加速機(jī)體抑制腹部術(shù)后的應(yīng)激反應(yīng)。研究表明，耳穴貼壓能降低剖宮產(chǎn)術(shù)后及不孕患者行體外受精-胚胎移植術(shù)后的血清皮質(zhì)醇濃度[16]，可能與耳穴貼壓有助于調(diào)節(jié)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

3.3耳穴貼壓有助于降低iNOS表達(dá)，促進(jìn)C-kit蛋白陽(yáng)性表達(dá) iNOS僅在應(yīng)激狀態(tài)下高度表達(dá)，胃腸手術(shù)的應(yīng)激狀態(tài)使巨噬細(xì)胞上調(diào)iNOS表達(dá)，并產(chǎn)生一氧化氮作用于Cajal細(xì)胞，抑制其產(chǎn)生起搏電位，使得平滑肌松弛，過(guò)多的一氧化氮可激活胃腸道內(nèi)的巨噬細(xì)胞發(fā)揮其細(xì)胞毒性，引起胃腸組織損傷[17]。Cajal細(xì)胞是胃腸運(yùn)動(dòng)的起搏細(xì)胞，腹部手術(shù)破壞胃腸道的完整性，Cajal細(xì)胞數(shù)量減少且網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞[18]。C-kit蛋白作為Cajal細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，具有調(diào)控Cajal細(xì)胞增殖與發(fā)育的作用[19]。本研究結(jié)果表明，iNOS活性水平在耳穴組和模型組之間差異顯著，耳穴組iNOS活性水平與空白組家兔結(jié)果接近；耳穴組干預(yù)后C-kit蛋白濃度顯著高于模型組，但低于空白組，提示耳穴貼壓有助于減少iNOS表達(dá)與催化，降低一氧化氮對(duì)Cajal細(xì)胞的抑制作用；耳穴貼壓在一定程度上可促進(jìn)C-kit蛋白表達(dá)，促進(jìn)Cajal細(xì)胞修復(fù)與增殖，有助于胃腸蠕動(dòng)恢復(fù)。

3.4基于氣機(jī)升降理論耳穴貼壓改善腹部術(shù)后胃腸功能的機(jī)制 《素問(wèn)·六微旨大論篇》曰：“是以升降出入，無(wú)器不有?！盵20]氣機(jī)的升降出入運(yùn)動(dòng)是人體生命活動(dòng)和臟腑功能的基本表現(xiàn)形式，若氣機(jī)運(yùn)動(dòng)失常便會(huì)引發(fā)疾病。脾宜升則健，胃宜降則和，脾胃為臟腑氣機(jī)升降之樞紐，人體之斡旋[21]。脾胃氣機(jī)出現(xiàn)升降不及或升降反作，則可直接導(dǎo)致胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙[22]。中醫(yī)學(xué)通常將術(shù)后胃腸功能紊亂歸屬于“腸痹”“腸結(jié)”等范疇，認(rèn)為術(shù)后脾胃氣虛氣滯，腑氣不通，脾胃升降失常是胃腸功能障礙的病機(jī)所在[23]。本研究結(jié)果顯示，耳穴貼壓有助于促進(jìn)家兔腹部術(shù)后胃腸蠕動(dòng)，降低應(yīng)激反應(yīng)，加速胃腸動(dòng)力恢復(fù)。耳廓的經(jīng)絡(luò)與神經(jīng)分布豐富，并與人體的臟腑經(jīng)絡(luò)組織一一對(duì)應(yīng)?！鹅`樞》記載：“十二經(jīng)脈，三百六十五絡(luò)，其血?dú)饨陨嫌诿娑呖崭[。共別氣走于耳而為聽(tīng)”[24]。刺激耳穴陽(yáng)性反應(yīng)點(diǎn)對(duì)于相應(yīng)的臟腑經(jīng)絡(luò)組織可以起到疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)暢氣血作用[25]。本研究選取胃、大腸、耳中皆為腹部穴位，胃主納降下行，大腸主傳化糟粕、主津，耳中穴主要調(diào)節(jié)胃的功能，對(duì)上述穴位進(jìn)行按壓刺激，共同調(diào)節(jié)胃腸氣機(jī)，推動(dòng)清氣上升濁氣下降，順氣導(dǎo)滯，臟腑氣機(jī)正常運(yùn)行，從而促進(jìn)術(shù)后胃腸功能恢復(fù)。

綜上所述，耳穴貼壓通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體應(yīng)激水平來(lái)控制因手術(shù)等應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)生表達(dá)的iNOS，并促進(jìn)C-kit蛋白表達(dá)，促進(jìn)Cajal細(xì)胞增殖與修復(fù)是其可能機(jī)制之一，這可為耳穴貼壓早期干預(yù)腹部術(shù)后提供理論依據(jù)。但其具體的作用通路目前尚不清楚，同時(shí)Cajal細(xì)胞表達(dá)受到如炎癥因子、配體血清干細(xì)胞因子、腸神經(jīng)系統(tǒng)等諸多因素的影響，耳穴貼壓療法是否能對(duì)其調(diào)節(jié)進(jìn)而影響Cajal細(xì)胞，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。