c-Myc、Bcl-2和Bcl-6蛋白表達對原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的治療選擇和預后影響

李春雨 戴文露 馬榮冰 高艷林 王風霞 張 璞 李德鵬 黃一虹

原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma, PCNSL)屬于相對罕見的結外侵襲性非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma, NHL)的一種特殊類型，僅局限于腦實質(zhì)、顱神經(jīng)、軟腦膜、眼內(nèi)和脊髓等且無其他淋巴結或淋巴組織受累，占所有NHL的2%～3%，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的3%，近年來其發(fā)生率有升高趨勢[1]。絕大多數(shù)PCNSL病理特征與彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)相似，PCNS-DLBCL來源于一種獨特的活化B淋巴細胞，作為結外NHL的一個獨立實體，早期診斷困難，腫瘤侵襲性強，療效不佳，預后較差[2]。目前對于系統(tǒng)性DLBCL中c-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因變異以及相關蛋白的表達情況及其對預后判斷和治療的研究較多，且大多認為表達Bcl-2及雙表達DLBCL與預后不良有關[3,4]。而上述蛋白表達及基因異常在PCNSL患者中的預后意義報道較少，且存在爭議[5,6]。因此，本研究對56例PCNS-DLBCL患者臨床相關指標、病理學特征、治療方案及其預后相關因素進行分析，旨在探討c-Myc、Bcl-2和Bcl-6蛋白表達與生存預后及治療方案選擇的相關性，為臨床早期診斷、選擇適宜治療方案及預后判斷上提供一定的臨床依據(jù)。

資料與方法

1.研究對象：收集2012年3月～2019年10月經(jīng)徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院及徐州市中心醫(yī)院診治的56例PCNSL患者的臨床資料，包括一般信息、發(fā)病癥狀、A/B癥狀(B癥狀指發(fā)熱、盜汗、體重下降等癥狀，A癥狀指無這些癥狀)、體能狀態(tài)評分、病灶部位、單發(fā)/多發(fā)、實驗室檢查、影像學及病理學資料、治療方法等。納入標準：①經(jīng)手術切除或立體定位后取得腫瘤組織經(jīng)組織病理學及免疫組織化學染色(IHC)明確病理類型(均為DLBCL)；②診斷均符合2016年WHO造血與淋巴組織腫瘤分類中PCNSL的診斷標準[7]，均未發(fā)現(xiàn)全身淋巴造血組織和其他系統(tǒng)受累的表現(xiàn)，且臨床資料完整。排除標準：①有其他惡性腫瘤、獲得性免疫缺陷病(艾滋病等)、自身免疫性疾病、長期服用免疫抑制劑及器官移植等疾病史；②臨床資料不完整或失訪。本研究通過筆者醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會審批(倫理審批號：XYFY2022-KL191)。

2.組織病理學及免疫組化染色：全部組織標本經(jīng)手術或立體定位活檢獲得，標本均經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，行3μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察組織病理學形態(tài)。IHC采用EnVision二步法，DAKO免疫化學儀上檢測CD20、CD10、c-Myc、Bcl-2、Bcl-6、Mum-1等，所有試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，具體步驟根據(jù)試劑說明書進行操作。結果判定標準：Bcl-2蛋白陽性率≥50%、c-Myc蛋白陽性率≥40%判定為表達陽性；當Bcl-6、CD10、Mum-1蛋白陽性率≥30%判定為表達陽性；當Bcl-2蛋白陽性率≥50%同時c-Myc蛋白陽性率≥40%時定義為c-Myc/Bcl-2蛋白雙表達[8]。根據(jù)Hans模型將PCNSL分為生發(fā)中心型(GCB型)和非生發(fā)中心型(non-GCB型)[9]。

3.治療方案：化療方案：HD-MTX為基礎聯(lián)合化療(HD-MTX 3.0～3.5g/m2+利妥昔單抗375mg/m2+替莫唑胺或阿糖胞苷)，MTX 靜脈滴注維持3h，結束后12h，予亞葉酸鈣(CF)解救；CHOP樣方案(環(huán)磷酰胺、表柔比星、長春新堿、潑尼松)。放療方案：全顱腦照射(40～50Gy，分割劑量1.8～2.0Gy)加局部增強照射(8～16Gy)。化療至少4周期、口服BTK抑制劑(伊布替尼)至少3 個月或出現(xiàn)進展可評估療效。

4.療效評估：療效評價根據(jù)國際PCNSL協(xié)作組標準[10]，并分類如下：完全緩解(CR)、部分緩解(PR)，疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進展(PD)。CR和PR為有效，SD和PD 為無效?？傮w反應率(ORR)被定義為治療期間完全或部分緩解的比例。

5.隨訪：隨訪時間截至2021年10月31日，總生存時間(OS)定義為從疾病診斷時間至死亡或隨訪截止時間。

6.統(tǒng)計學方法：應用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。生存分析采用Kaplan-Meier法，使用Log-Rank檢驗比較組間的生存差異，采用COX比例風險回歸模型進行多因素預后分析，分類變量組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.一般臨床特征：56例PCNSL患者，患者年齡為24～80歲，中位年齡為58歲，其中男性32例，女性24例，男女性別比為1.33∶1。臨床以頭痛、惡心、嘔吐、顱內(nèi)壓增高及其他伴隨癥狀為首發(fā)癥狀30例，以肢體乏力、共濟失調(diào)和運動障礙為初始表現(xiàn)18例，意識障礙3例，以行為異常、性格改變等為首要癥狀2例，以言語不清為初始表現(xiàn)2例，視覺障礙1例?；颊呔鶡o發(fā)熱、盜汗、體重下降等B癥狀。影像學檢查：單發(fā)病灶38例，多發(fā)病灶18例，病灶位于淺表腦組織36例，累及深部腦組織20例，初診時LDH升高17例。56例患者中有24例行鞘內(nèi)注射治療，并完善腦脊液檢查，其中腦脊液蛋白升高19例，美國東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)評分≥2分29例，國際結外淋巴瘤研究組(IELSG)評分≥2分28例(表1)。

表1 PCNSL 56例患者臨床、病理學特征及治療選擇與生存的相關性

2.病理特征及免疫組化分型:56例經(jīng)病理形態(tài)學及IHC檢測明確診斷，均為DLBCL，且均表達CD20。

多發(fā)病灶：在一個或多個腦部受累區(qū)域≥2個病變；病灶累及腦組織深部：包括腦室旁區(qū)域、胼胝體、基底核、腦干及小腦； IELSG評分：國際結外淋巴瘤研究小組評分，評分時未包括腦脊液蛋白含量參數(shù)；NA：未達到

Bcl-2蛋白陽性31例(55.4%)，c-Myc蛋白陽性36例(64.3%)，Bcl-6蛋白陽性39例(69.6%)，c-Myc/Bcl-2蛋白雙表達23例(41.1%)，non-GCB型40例(71.4%)，詳見表1。

3.治療選擇及療效分析：56例PCNSL患者中43例采用多藥聯(lián)合化療作為一線治療方案，13例采取化療聯(lián)合全腦放療的綜合治療，包括1例聯(lián)合嵌合抗原受體T細胞免疫療法(CAR-T)。49例予HD-MTX為基礎聯(lián)合化療，7例接受CHOP樣方案治療。37例聯(lián)合利妥昔單抗治療，15例聯(lián)用BTK抑制劑治療。綜合治療相比于單純化療中位生存期延長，聯(lián)用BTK抑制劑治療相比于未聯(lián)用患者中位生存時間延長，但差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。對予HD-MTX治療患者行療效評估，11例患者達CR，19例患者達PR，ORR為61.2%，其中19例c -Myc/Bcl-2蛋白雙表達的患者ORR為42.1%，30例非雙表達患者ORR為73.3%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.029)。15例聯(lián)合伊布替尼治療，其中non-GCB患者ORR為77.8%(7/9)，GCB患者ORR為16.7%(1/6)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.041)。而療效在患者性別、年齡、病灶數(shù)目、是否累及深部腦組織、LDH、腦脊液蛋白、ECOG評分、IELSG評分、是否聯(lián)合利妥昔單抗之間比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

4.生存分析及預后影響因素：56例PCNSL患者隨訪時間24～73個月，中位生存時間為25個月，2年生存率為50.0%。單因素預后分析顯示：Bcl-2蛋白陰性、Bcl-6蛋白陽性、非c-Myc/Bcl-2蛋白雙表達、IELSG評分<2分、ECOG評分<2分及給予HD-MTX治療患者的中位OS均顯著高于Bcl-2蛋白陽性、Bcl-6蛋白陰性、c-Myc/Bcl-2蛋白雙表達、IELSG評分≥2分、ECOG評分≥2分及未予HD-MTX治療的患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而性別、年齡、病灶數(shù)目、是否累及深部腦組織、初診時LDH、腦脊液蛋白含量、Hans分型及在HD-MTX基礎上是否聯(lián)合利妥昔單抗與患者預后無關。COX多因素風險回歸分析Bcl-2蛋白陽性、c-Myc/Bcl-2蛋白雙表達及未予HD-MTX治療是影響PCNSL患者OS的獨立不良預后因素(表1、表2，圖1～3)。

表2 影響PCNSL患者預后的COX多因素生存分析

圖1 Bcl-2蛋白陽性表達與陰性患者的生存曲線

圖2 c-Myc/Bcl-2蛋白雙表達和非雙表達患者的生存曲線

圖3 HD-MTX治療和未予HD-MTX治療患者的生存曲線

討 論

PCNSL是一種臨床上相對少見的高侵襲性的結外NHL亞型，在免疫缺陷人群中發(fā)生率相對較高，但近年來在免疫功能正常的個體中發(fā)生率逐漸上升，老年人群更加明顯，本組研究對象均為免疫功能正常的患者，中位發(fā)病年齡58歲，與國外報道的中位年齡67歲比較相對年輕[1]。PCNSL的組織病理類型以DLBCL最常見，PCNS-DLBCL臨床多表現(xiàn)為病灶在中樞神經(jīng)系統(tǒng)占位相關的特征，極少伴隨B癥狀，本組臨床資料顯示了相似的臨床特點。PCNSL具有高度侵襲性的生物學行為，臨床療效和預后差，目前尚無明確的預后不良相關因素，臨床上探索可用于評估其預后的相關指標，從而進行針對性治療選擇來改善預后具有重要意義。

大量研究表明，在DLBCL中c-Myc、Bcl-2蛋白表達和雙表達多與不良預后相關[3,4]。同時有研究認為，PCNS-DLBCL中Bcl-2過表達和c-Myc/Bcl-2雙表達是影響預后的獨立危險因素[5,6]。也有研究認為，由于疾病生物學的差異，用于預測非特指型DLBCL預后的c-Myc蛋白表達可能并不適用于PCNSL[11]。本研究提示，Bcl-2蛋白陽性和c-Myc/Bcl-2雙表達與較差的預后相關，并未發(fā)現(xiàn)c-Myc、Bcl-6蛋白表達改變與預后的相關性，可能由于樣本量有限，結果差異性較大，尚需要擴大樣本量進一步研究。研究還發(fā)現(xiàn)，DLBCL中的c-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因變異對預后具有一定意義，尤其是發(fā)生c-Myc/Bcl-2易位的雙打擊B細胞淋巴瘤 (double expression lymphoma, DHL) 預后明顯差于非雙打擊DLBCL，但在PCNSL中其基因異常與預后關系尚未明確[12]。目前DHL的診斷依賴于熒光原位免疫雜交(FISH)，但此項檢查耗時長、成本高，在本研究中因缺失值較多，未能進行c-Myc/Bcl-2/Bcl-6基因異常與蛋白表達及預后關系分析。

為評估PCNSL的預后，現(xiàn)已有IELSG評分、紀念斯隆-凱特琳癌癥中心(MSKCC)評分，新的評分系統(tǒng)可進行危險度分層，其中IELSG評分是被廣泛接受的風險模型，其提出的5個預后因素包括年齡>60歲、ECOG評分≥2分、LDH水平升高、腦脊液蛋白濃度升高及病灶累及深部腦組織[13～15]。每個因素1分，其危險分組標準為：低危組(0～1分)、中危組(2～3分)、高危組(4～5分)。本研究中腦脊液蛋白缺失值比例較高，因此在進行 IELSG 評分時未包括該參數(shù)。單因素分析顯示低危組與中高危組患者相比較OS顯著延長，多因素分析顯示，低危組與中高危組患者預后并無顯著性差異，這一結果與其他文獻結果并不一致，IELSG 評分為低危組但生存預后仍然較差，說明原發(fā)部位本身存在固有生物學特征以及疾病臨床異質(zhì)性較強[16]?？赡芘c以下因素有關：①本研究為單中心回顧性研究，對ECOG評分的評判由于受主觀影響，腦組織深部受累的評判可能存在偏倚；②因腦脊液蛋白未納入IELSG評分系統(tǒng)造成結果比較的局限性。

PCNSL的治療尚無標準方案，目前推薦以HD-MTX為基礎的多藥聯(lián)合化療作為一線治療方案[17]。本研究提示HD-MTX為基礎治療組與CHOP樣治療組患者比較OS顯著延長。筆者比較了在予以HD-MTX治療的患者中，Bcl-2、c-Myc、Bcl-6蛋白表達及c-Myc/Bcl-2雙表達與療效的關系，結果顯示c-Myc/Bcl-2雙表達的患者表現(xiàn)出更差的ORR，這與既往文獻報道一致[18]。利妥昔單抗因其難以透過血-腦脊液屏障，導致它在 PCNSL治療中的地位仍飽受爭議[19]。在本研究中，聯(lián)合利妥昔單抗與未聯(lián)合利妥昔單抗治療患者兩組間預后差異不明顯，考慮可能與組別樣本量有限、隨訪時間不夠等因素有關。BTK抑制劑用于PCNSL治療的機制為抑制BTK酶活性，阻斷B淋巴細胞活化及B淋巴細胞受體下游信號通路。一項前瞻性研究顯示，伊布替尼用于治療52例復發(fā)/難治性PCNSL患者，顯示其反應率為52%，較高劑量時可能使腦脊液中藥物濃度增加并保持良好的耐受性[20]。Lionakis等[21]觀察BTK抑制劑伊布替尼用于18例新診斷和復發(fā)難治性PCNSL患者治療，結果發(fā)現(xiàn)腫瘤體積縮小顯著。筆者對non-GCB型和GCB型中聯(lián)用BTK抑制劑的PCNSL患者療效進行比較，non-GCB型患者顯示出較好的ORR，與文獻報道一致[22]。本研究中non-GCB型患者ORR 相比Wilson等報道的關于伊布替尼治療復發(fā)/難治PCNS-DLBCL療效偏高，可能的原因為：①伊布替尼治療PCNSL療效好于系統(tǒng)性DLBCL；②本研究中并非全為復發(fā)/難治患者；③樣本量有限。這也提示在臨床工作中應更加重視免疫學分型，并根據(jù)不同的免疫組化特點和免疫表型采取不同的治療策略，BTK抑制劑應用于PCNSL治療可能是未來治療方向之一。

綜上所述，本研究提示Bcl-2蛋白陽性、c-Myc/Bcl-2蛋白雙表達是影響PCNSL患者預后的獨立危險因素。HD-MTX為基礎的聯(lián)合化療可明顯延長患者生存期。聯(lián)合BTK抑制劑用于non-GCB 型PCNSL可獲得較好的ORR。這一結論為PCNSL治療方案選擇及預后判斷上提供一定的臨床依據(jù)，但PCNSL惡性程度高且進展快，仍需優(yōu)化PCNS-DLBCL有效治療策略，進一步提高療效并最終改善患者的生存預后進行積極的探索。