S100A16與成骨分化的生物信息學分析及功能驗證

辛 婧 沈亞非 王朝旭 謝亞爭

S100A16是鈣調(diào)蛋白S100家族的新成員，S100蛋白與細胞增殖、分化、凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，S100A16在正常食道、脂肪、肺、甲狀腺、胰腺、結(jié)腸等組織中高表達，且在不同的組織中參與了不同的細胞發(fā)育、細胞生長和細胞凋亡作用，有可能存在比S100家族其他成員更復雜的調(diào)控機制[1,2]。S100A16是筆者課題組在前期對肥胖相關(guān)基因研究中通過基因芯片篩查到的差異表達基因，并證實S100A16促進前體脂肪細胞分化、脂質(zhì)合成從而促使肥胖發(fā)生[3,4]。脂肪細胞和成骨細胞均來源于間充質(zhì)干細胞，兩者存在此消彼長的關(guān)系，即S100A16促進脂肪細胞分化的同時可能抑制成骨細胞生成[5]。目前，S100A16與成骨分化的相關(guān)性研究鮮見報道。本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫的高通量測序數(shù)據(jù)對S100A16與成骨分化進行生物信息學相關(guān)性分析，并通過構(gòu)建S100A16慢病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞誘導成骨分化，觀察S100A16對成骨分化的影響，初步探討S100A16基因在成骨分化中的作用，為進一步研究骨質(zhì)疏松發(fā)生的分子機制及尋找新的治療靶點提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.數(shù)據(jù)庫及分析數(shù)據(jù)：采用來自美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，GEO)和可視化平臺GEO2R對S100A16與成骨分化進行生物信息學相關(guān)性分析。

2.材料：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；地塞米松、茜素紅、FBS緩沖液、β-甘油磷酸鈉購自美國Sigma公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、real-time PCR反應(yīng)試劑盒購自日本TaKaRa公司；PLKO.1-sP6-GFP空病毒載體由南京醫(yī)科大學分子遺傳研究室李建民教授饋贈；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；Pierce BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；S100A16、CD14、CD34、CD45、CD44、CD90、CD105兔源一抗、PE偶聯(lián)羊抗兔二抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；IgG-辣根過氧化物酶羊抗兔二抗、β-actin抗體購自美國CST公司。

3.生物信息學數(shù)據(jù)處理：根據(jù)GEO數(shù)據(jù)集中不同收錄信息，通過轉(zhuǎn)錄組測序檢測S100A16在正常C57BL6小鼠各主要組織器官中的表達情況(GEO測序數(shù)據(jù)登錄號：GDS3142)；檢測4組正常MC3TC-E1成骨前體細胞(control)、3組曲古抑菌素 A誘導成骨分化的成骨前體細胞(TSA treated)中S100A16的表達情況(GEO測序數(shù)據(jù)登錄號：GSE92470)。在GEO2R分析頁面輸入GEO測序數(shù)據(jù)登錄號，確定樣本分組后，使用默認參數(shù)進行S100A16的表達量分析，導出生成的柱狀圖。

4.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離與培養(yǎng)：所有動物實驗和操作順序經(jīng)漯河市中心醫(yī)院動物倫理委員會批準通過(審批號：2020018)，嚴格遵守動物實驗倫理條例，并按照國家衛(wèi)生研究院“實驗動物保護和使用指南”的規(guī)定執(zhí)行。頸椎脫臼處死大鼠后用75%乙醇溶液浸泡15min，無菌操作分離股骨與脛骨，用DMEM培養(yǎng)液吸取大鼠骨髓輕吹打使溶液混勻，選用22號注射針頭濾制溶液制備成單細胞懸液，接種在細胞培養(yǎng)皿，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng),每2～3天換液。傳至第3代流式細胞儀鑒定為骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)。

5.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞表面標志物的鑒定：選取第3代生長狀態(tài)良好的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，胰酶消化3min，收集細胞懸液于1000r/min室溫離心5min，棄上清后用無菌PBS重懸細胞并過200目篩網(wǎng)制成單細胞懸液。各管樣本分別加入CD44、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45的單克隆抗體，同時設(shè)立同型陰性對照，4℃避光孵育，用流式細胞儀進行檢測。

6.慢病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞并誘導成骨分化:筆者課題組早期構(gòu)建了過表達S100A16慢病毒載體(PLJM1-S100A16-GFP)，轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs并篩選穩(wěn)定感染細胞株，建立S100A16過表達組、空載對照組和未轉(zhuǎn)染載體的正常BMSCs組。分別加入成骨細胞誘導液(含10%PBS的DMEM培養(yǎng)基+10mmol/L β甘油磷酸鈉+0.05mmol/L維生素C+100mmol/L地塞米松)，每3天換液1次，持續(xù)誘導培養(yǎng)21天，檢測相關(guān)指標。

7.Western blot法檢測：分別抽提第3代正常BMSCs組、轉(zhuǎn)入慢病毒載體PLJM1-S100A16-GFP的S100A16過表達組及轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒PLJM1的空載對照組的總蛋白質(zhì)，測定蛋白質(zhì)濃度，制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，100V穩(wěn)壓電泳，半干轉(zhuǎn)膜。一抗為濃度1∶500的S100A16多克隆抗體，二抗為1∶2000的羊抗兔IgG一辣根過氧化物酶，用免疫印跡化學發(fā)光法檢測。以 GAPDH 作為內(nèi)參，應(yīng)用 Image J軟件分析各組蛋白條帶灰度比值的變化。

8.RT-PCR檢測成骨細胞相關(guān)因子mRNA表達水平：取S100A16過表達組、空載對照組、正常BMSCs組的第3代BMSCs細胞，誘導成骨分化，培養(yǎng)14天提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，利用實時定量PCR檢測成骨分化相關(guān)因子堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄核心因子 2(Runx2)的表達，GAPDH 設(shè)為內(nèi)參，結(jié)果以2-ΔΔCt表示，繪制柱狀圖。相關(guān)引物序列詳見表1。

表1 實時定量PCR引物序列

9.茜素紅染色檢測成骨分化能力：在BMSCs向成骨分化過程中，細胞表面沉積鈣鹽形成鈣結(jié)節(jié)，茜素紅與鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，通過茜素紅染色鑒定鈣結(jié)節(jié)形成情況。BMSCs 成骨誘導分化21天后，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌 2～3 次，甲醛緩沖液固定15min，蒸餾水洗滌3次，加入0.1%茜素紅-Tris-HCL染液(pH值為8.3)，37℃下染色30min，蒸餾水沖洗，顯微鏡下觀察茜素紅染色陽性細胞。

結(jié) 果

1.S100A16在各組織中的表達情況生物信息學分析：轉(zhuǎn)錄組測序檢測S100A16在正常C57BL6小鼠各主要組織器官中的表達情況，分析發(fā)現(xiàn)S100A16基因在骨髓中的表達顯著低于其他組織(圖1)，提示其表達與成骨呈負相關(guān)。

圖1 S100A16在正常C57BL6小鼠各主要組織器官中的表達情況

2.S100A16在成骨細胞分化中的表達情況分析：已有文章表明曲古抑菌素 A可促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[6，7]。轉(zhuǎn)錄組測序?qū)Ρ日C3TC-E1成骨前體細胞(control)和曲古抑菌素 A誘導成骨分化的成骨前體細胞(TSA treated)中S100A16的表達情況，分析發(fā)現(xiàn)S100A16基因在經(jīng)TSA誘導成骨分化的細胞中表達量顯著降低(圖2)，提示S100A16表達量與成骨分化呈負相關(guān)。

圖2 S100A16在正常成骨前體細胞組和曲古抑菌素A誘導分化組中的表達情況

3.骨髓間充質(zhì)干細胞流式鑒定：取生長狀態(tài)良好的第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，經(jīng)流式細胞儀鑒定細胞表面標志物，結(jié)果顯示CD44、CD90和CD105的陽性率分別為96.6%、96.9%和97.7%。而CD14、CD34和CD45呈陰性表達(圖3)，符合骨髓間充質(zhì)干細胞特征。

圖3 流式鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞表面標志物骨髓間充質(zhì)干細胞表面陽性標志物(CD44、CD90和CD105)表達均在96%以上，陰性標志物(CD44、CD34和CD45)表達均在2%以下，均符合要求

4.S100A16在各組細胞的表達情況：收集各組細胞蛋白，Western blot法檢測結(jié)果顯示，S100A16過表達組(PLJM1-S100A16-GFP-BMSCs)與空載對照組(PLJM1-BMSCs)及正常BMSCs組比較，S100A16蛋白表達顯著升高(P<0.05,圖4)，表明S100A16穩(wěn)定高表達細胞株構(gòu)建成功。

圖4 S100A16蛋白表達情況A.S100A16蛋白表達的免疫印跡條帶；B.S100A16相對于GAPDH蛋白表達水平的灰度值；*P<0.05

5.各組細胞成骨分化相關(guān)因子mRNA表達情況:實時定量PCR結(jié)果顯示，S100A16過表達組(PLJM1-S100A16-GFP-BMSCs)細胞成骨分化相關(guān)因子ALP、OCN、Runx2的mRNA表達水平較正常BMSCs組及空載對照組表達明顯下降(圖5)，說明S100A16抑制成骨分化。

圖5 細胞成骨分化相關(guān)因子mRNA的表達情況ALP.堿性磷酸酶；OCN.骨鈣素；Runx2.Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄核心因子2；*P<0.05

6.茜素紅染色觀察各組細胞骨礦化結(jié)節(jié)形成情況：各組BMSCs成骨誘導分化21天，茜素紅染色顯示S100A16過表達組(PLJM1-S100A16-GFP-BMSCs)礦化結(jié)節(jié)形成較正常BMSCs組和空載對照組明顯減少(圖6)。

圖6 各組細胞成骨誘導21天后茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況(×200)A.正常BMSCs組；B.空載對照組；C.S100A16過表達組

討 論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種與年齡、性別、環(huán)境、遺傳等相關(guān)的退行性疾病，主要的危害就是發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折[8,9]。近年來，國家重點宣傳“全民健康，三減三健”的主題，其中包括健康骨骼，骨質(zhì)疏松是全民需要重視的問題。骨質(zhì)疏松導致的髖部骨折被稱為是“人生最后一次骨折”，我國骨質(zhì)疏松癥患者髖部骨折的平均年齡是67.2歲，每年醫(yī)療費用估計需要150億元人民幣[10,11]。因此，骨質(zhì)疏松給家庭和社會都帶來了極大的負擔和壓力，這是現(xiàn)代人口老齡化社會的一個亟需解決的健康問題，需要有效的防治策略。骨質(zhì)疏松的主要致病因素是骨吸收增強和骨形成能力減弱。成骨細胞分化在調(diào)控骨形成中發(fā)揮重要作用，也是目前研究的熱點。本研究通過探討S100A16與成骨分化的相關(guān)性為骨質(zhì)疏松癥的早期診斷分子標志物的篩選及分子靶向治療提供新的思路。

骨髓間充質(zhì)干細胞在一定條件下可分化為脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞，在BMSCs分化過程中，成脂分化和成骨分化呈負相關(guān)，成脂-成骨分化狀態(tài)依賴于多種轉(zhuǎn)錄因子和信號通路共同調(diào)控[12]。S100A16是筆者課題組在前期對肥胖相關(guān)基因研究中通過基因芯片篩查到的差異表達基因。筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，S100A16能夠促進前體脂肪細胞分化、脂質(zhì)合成集聚從而導致肥胖發(fā)生[13,14]。另有研究顯示，肥胖患者脂肪分化增加、成骨分化減少，成骨細胞被脂肪細胞替代、骨髓被脂肪填充致骨礦化密度下降可引發(fā)骨質(zhì)疏松傾向[15,16]。而骨質(zhì)疏松癥患者骨量減少的同時伴有骨髓脂肪組織增加致骨礦化密度下降[17]。這些均提示S100A16在促進脂肪分化同時抑制成骨分化，筆者推測S100A16與成骨分化呈負相關(guān)。目前S100A16作為促進脂肪細胞分化和形成的關(guān)鍵因子，是否影響且如何影響成骨分化無相關(guān)報道。

為此，本研究首先進行了S100A16的表達與成骨分化的生物信息學相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，S100A16基因在骨髓中的表達顯著低于其他組織，提示其與成骨呈負相關(guān)；S100A16基因在經(jīng)曲古抑菌素A誘導成骨分化細胞中表達量較正常對照組顯著降低，提示S100A16表達與成骨細胞分化呈負相關(guān)。為進一步驗證S100A16與成骨分化的相關(guān)性，首先分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，經(jīng)流式細胞儀鑒定細胞表面標志物，結(jié)果顯示，CD44、CD90和CD105的陽性率均大于90%，CD14、CD34和CD45呈陰性表達，符合骨髓間充質(zhì)干細胞特征。筆者構(gòu)建S100A16高表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞并誘導成骨分化，研究S100A16對成骨分化的影響。從蛋白水平驗證S100A16穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株構(gòu)建成功。與正常BMSCs組和空載對照組比較，S100A16高表達下調(diào)骨髓間充質(zhì)干細胞誘導成骨分化過程中成骨分化相關(guān)因子堿性磷酸酶、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄核心因子 2的表達。礦化結(jié)節(jié)是成骨細胞分化成熟的形態(tài)學表現(xiàn)，通過茜素紅染色筆者觀察到S100A16高表達組礦化結(jié)節(jié)明顯少于空載對照組，說明S100A16抑制成骨分化。因此，筆者推測S100A16通過調(diào)控成骨細胞的分化而促使骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展。目前缺乏關(guān)于S100A16參與成骨細胞分化及骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究，因此兩者關(guān)系及其作用機制還需進一步基礎(chǔ)研究及后續(xù)隨機、多中心的大樣本量分析加以論證和核實。

綜上所述，生物信息學分析及實驗研究結(jié)果顯示，S100A16表達與成骨分化呈負相關(guān)，它作為全新的成骨分化呈負性調(diào)控因子可能是抗骨質(zhì)疏松的潛在治療靶點，值得進一步探索。本研究的意義在于豐富成骨分化和骨質(zhì)疏松理論基礎(chǔ)研究的同時，也將為骨質(zhì)疏松癥的篩查及防治提供新的研究方向。