Mfn2通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕椎間盤退變大鼠髓核細(xì)胞凋亡

范 鍥 李文浩 陳 鋒 唐 林 李浩曦

椎間盤退行性變(intervertbal disc degeneration, IDD)是造成下腰痛的主要原因[1]。髓核(nucleus pulposus, NP)細(xì)胞的數(shù)量及活性對維持椎間盤功能和結(jié)構(gòu)具有重要意義，NP細(xì)胞凋亡、壞死引起的NP退變是誘導(dǎo)IDD的基礎(chǔ)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)介導(dǎo)的凋亡是近年來發(fā)現(xiàn)的新凋亡途徑(包括PERK/eIF2α/ATF4/CHOP、IRE1α/JNK、IRE1α/caspase-12)[2]。其中PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路與多種疾病(如肝癌、糖尿病)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，阻斷該通路可抑制NP細(xì)胞凋亡，改善IDD[3～5]。線粒體融合蛋白2(mitofusin2, Mfn2)除了調(diào)控線粒體融合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及凋亡等生物學(xué)過程，還在調(diào)控ERS及維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)中有重要作用。Mfn2在IDD患者退變NP組織中低表達(dá)，過表達(dá)其可抑制自噬減少NP細(xì)胞凋亡[6]。此外，筆者預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NP細(xì)胞中Mfn2與PERK存在相互作用關(guān)系，提示Mfn2或能通過ERS途徑影響NP細(xì)胞凋亡參與IDD過程。本實(shí)驗(yàn)探究過表達(dá)Mfn2阻遏ERS對大鼠退變NP細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制，旨在尋找IDD潛在的新治療靶點(diǎn)。

材料與方法

1.動物：SPF級SD大鼠10只，7周齡，雄性，體質(zhì)量為200±20g。由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供(動物使用許可證號：SYXK桂2020-0004)。

2.主要試劑及儀器：4-PBA、TRIzol、Binding Buffer、Lipofectamine?2000、MTT試劑盒購自美國Sigma公司；胎牛血清、PBS、DMEM/F12、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；Annexin V-FITC、Western/IP裂解液購自上海碧云天公司生物技術(shù)有限公司；一抗Mfn2、PERK、p-PERK、ATF4、eIF2α、p-eIF2α、CHOP、GRP78、Bcl-2、Bax、caspase-3、GAPDH、二抗羊抗鼠、羊抗兔購自英國Abcam公司；Protein A&G Agarose購自美國賽默飛公司；低溫離心機(jī)5418R購自德國Eppendorf公司；酶標(biāo)儀(FilterMax F3)購自美國MD公司；qRT-PCR分析儀(AiraMx)購自美國Agilent公司；核酸檢測儀(FC-1100)購自杭州遂真公司；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 5200)購自上海天能公司；流式細(xì)胞儀(FACSCantoTM Ⅱ)購自美國BD公司。

3.IDD模型大鼠的建立：術(shù)前禁食8～12h。分為正常組和IDD組，每組5只。參照文獻(xiàn)[7,8]方法，IDD組大鼠尾靜脈注射戊巴比妥鈉(20mg/kg)麻醉，俯臥位固定，以髂嵴(髂嵴上緣平對L6～7椎間盤)作橫向定位。切開L6～7椎間盤部位1.0cm到白色的椎間盤。平行于軟骨板進(jìn)針，插入纖維環(huán)深度3mm，旋轉(zhuǎn)360°，保持30s，拔針，縫合。正常組大鼠除不針刺外其余操作同IDD大鼠。大鼠蘇醒后在23±2℃、12h光/暗周期中飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。

4.大鼠NP細(xì)胞離體培養(yǎng)：大鼠安樂死，取出整個腰椎，消毒，置于超凈臺無菌培養(yǎng)皿中。切開并擴(kuò)張纖維環(huán)，暴露NP組織，與100×青霉素-鏈霉素置于PBS中。剪碎NP組織，參照文獻(xiàn)[8]方法，0.25%胰蛋白酶分離，DMEM/F12完全培養(yǎng)基孵育。離心棄上清，加0.2%Ⅱ型膠原酶，離心3h至組織塊消失。細(xì)胞按5×105個/毫升接種于培養(yǎng)瓶，3天更換1次培養(yǎng)液。形成單層后，0.25%胰蛋白酶分離傳代。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均為傳代至第1～3代。

5.細(xì)胞分組及處理：取正常組大鼠NP細(xì)胞作為control組；取IDD組NP細(xì)胞分為model組、OE-Mfn2組、OE-NC組、4-PBA組。將生工生物工程(上海)股份有限公司構(gòu)建并測序鑒定的攜帶Mfn2的腺病毒(Adv-Mfn2)和空載腺病毒(Adv-GFP)，用Lipofectamine?2000分別轉(zhuǎn)染至OE-Mfn2組和OE-NC組細(xì)胞；4-PBA組加入5mmol/L 4-PBA干預(yù)24h[9]；其余組不做處理。

6.Western blot法：PBS洗滌細(xì)胞，RIPA冰浴裂解，提總蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉-PBST室溫封閉1h，加一抗，4℃孵育過夜，加對應(yīng)HRP標(biāo)記二抗，37℃孵育1h，ECL顯影，Image J分析條帶。

7.qRT-PCR：TRIzol法提取總細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒提cDNA。SYBR Green法行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，95℃變性15s，退火20s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)，內(nèi)參β-actin，按2-ΔΔCt行數(shù)據(jù)分析。引物序列：Mfn2上游引物：5′-GTGCTCAACGCCAGGATTC-3′，下游引物：5′-AGTCGGTCTTGCCGCTCTT-3′；PERK上游引物：5′-AAGATGGTACAGTGGACGGC-3′，下游引物：5′-CCGTCTTCCTGGTGAAATCT-3′；ATF4上游引物：5′-GGTGCCTATGATGCCTTTAAGC-3′，下游引物：5′-GCTTTGGCTTCCATTTCTTCTC-3′；eIF2α上游引物：5′-CCAAACAACACTGTCCTGGC-3′，下游引物：5′-GGTTAGGGGTCCCAGCTGTA-3′；β-actin上游引物：5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物：5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3′。

8.免疫共沉淀(CO-IP)：用Western/IP裂解control組細(xì)胞提總蛋白，分別加Mfn2抗體(anti-Mfn2組)、PERK抗體(anti-PERK組)，4℃反應(yīng)1h后，加Protein A&G Agarose，3000r/min離心，4℃孵育過夜；Western/IP洗滌Protein A&G Agarose 3遍，加蛋白上樣緩沖液，沸水浴10min，得蛋白檢測樣品；行Western blot法檢測。同時設(shè)立陰性對照(IgG)組，在細(xì)胞裂解液中不加入Mfn2抗體、PERK抗體，其他步驟同上：陽性對照(input)組為不經(jīng)過Protein A&G Agarose吸附處理的樣品，其他步驟同上。

9.MTT：收集細(xì)胞，按MTT說明書，各實(shí)驗(yàn)孔加5mg/ml MTT 溶液20μl，37℃孵育4h，隨后加入DMSO 150μl，全自動酶標(biāo)儀檢測各孔A490值。

10.流式細(xì)胞術(shù)：細(xì)胞室溫離心5min，4℃ PBS重懸，離心洗滌，加入經(jīng)去離子水稀釋后的Binding Buffer懸浮，加入Annexin V-FITC混勻，避光，室溫孵育15min，加入PI標(biāo)記，加入稀釋后的Binding Buffer后上機(jī)檢測。

結(jié) 果

1.NP細(xì)胞中Mfn2水平比較(圖1)：與control組比較，model組Mfn2水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與model組比較，OE-Mfn2組與4-PBA組Mfn2mRNA和蛋白上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；OE-NC組與model組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 Western blot法和qRT-PCR檢測Mfn2蛋白、mRNA表達(dá)A.Mfn2蛋白電泳圖；B.Mfn2蛋白表達(dá)量比較；C.Mfn2mRNA表達(dá)量比較；與control組比較，*P<0.01;與model組比較，#P<0.01

2.NP細(xì)胞中Bcl-2、Bax、caspase-3水平、凋亡率及細(xì)胞活力比較(圖2～圖4)：與control組比較，model組細(xì)胞活力下降，凋亡率上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與model組比較，OE-Mfn2組與4-PBA組細(xì)胞活力上上升，凋亡率下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；OE-NC組與model組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與control組比較，model組Bcl-2蛋白水平下降，Bax、caspase-3蛋白水平上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與model組比較，OE-Mfn2組與4-PBA組Bcl-2蛋白水平上升，Bax、caspase-3蛋白水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；OE-NC組與model組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 Western blot法檢測Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)A.Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白電泳圖；B～D.Bcl-2、Bax、caspase-3表達(dá)量比較；與control組比較，*P<0.05,**P<0.01;與model組比較， #P<0.01

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率A～E分別為control、model、OE-Mfn2、OE-NC、4-PBA組；F.細(xì)胞凋亡率比較；與control組比較，*P<0.01;與model組比較；#P<0.01

圖4 MTT檢測細(xì)胞活力與control組比較，*P<0.01;與model組比較，#P<0.05, ##P<0.01

3.NP細(xì)胞中PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP及GRP78水平比較(圖5、6)：與control組比較，model組PERK、eIF2α、ATF4mRNA水平上升，PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP及GRP78蛋白水平上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與model組比較，OE-Mfn2組與4-PBA組PERK、eIF2α、ATF4mRNA水平降低，p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP及GRP78蛋白水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；OE-NC組與model組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖5 qRT-PCR檢測PERK、ATF4、eIF2α mRNA表達(dá)A～C分別為PERK、ATF4、eIF2α mRNA表達(dá)量的比較；與control組比較，*P<0.01;與model組比較，#P<0.01

圖6 Western blot法檢測p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP、GRP78蛋白表達(dá)A.p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP、GRP78蛋白電泳圖；B～H分別為p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP、GRP78相對表達(dá)量比較；與control組比較，*P<0.05, **P<0.01;與model組比較，#P<0.01

4.NP細(xì)胞中Mfn2與PERK存在相互作用關(guān)系(圖7)：CO-IP結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組(anti-Mfn2組和anti-PERK組)和input組均檢測到Mfn2組與PERK組蛋白條帶，而IgG組未檢測到，證實(shí)Mfn2和PERK形成了特異性結(jié)合復(fù)合物，在NP細(xì)胞中，Mfn2可與PERK特異性結(jié)合。

圖7 CO-IP驗(yàn)證Mfn2與PERK的蛋白相互作用關(guān)系

討 論

Mfn2位于線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)上，缺乏Mfn2會降低線粒體融合效率。Mfn2還參與細(xì)胞活化、增殖、凋亡等過程，沉默Mfn2基因?qū)?dǎo)致線粒體片段化，增強(qiáng)細(xì)胞對凋亡信號的敏感度[10]。相反，過表達(dá)Mfn2能促進(jìn)線粒體融合，阻滯多種凋亡信號誘導(dǎo)的Bax、caspase活化，抑制凋亡[11]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體在功能、結(jié)構(gòu)上緊密相依，Mfn2可作為“橋”介導(dǎo)線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間交流，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能。ERS凋亡過程中可觀察到Mfn2與Bax的共定位現(xiàn)象，表明Mfn2或參與調(diào)節(jié)ERS凋亡[12]。

IDD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要牽涉NP、軟骨板及纖維環(huán)，其中由細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的NP活性細(xì)胞數(shù)量減少是重要影響因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠退變NP細(xì)胞中凋亡率增加，細(xì)胞活性下降，Bax、caspase-3上調(diào)，Bcl-2下調(diào)，符合IDD損傷中退變NP細(xì)胞的凋亡機(jī)制，提示抑制凋亡是減輕IDD損傷的關(guān)鍵。而本研究發(fā)現(xiàn)，在退變NP細(xì)胞中，過表達(dá)Mfn2后Bax、caspase-3及凋亡率下調(diào)，Bcl-2及細(xì)胞活性上調(diào)，表明上調(diào)Mfn2可抑制NP細(xì)胞凋亡，結(jié)合文獻(xiàn)報道里ERS進(jìn)程中Mfn2與Bax的共定位現(xiàn)象，筆者推測Mfn2減輕NP細(xì)胞凋亡或與ERS途徑有關(guān)。

正常狀態(tài)，GRP78與PERK形成復(fù)合物抑制PERK活化，ERS清除未折疊蛋白而維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。IDD時，NP中蛋白合成紊亂且異常蓄積，當(dāng)積蓄未折疊蛋白超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)清除限度時，會促發(fā)ERS介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性凋亡，未折疊蛋白與PERK競爭GRP78，解綁PERK，p-PERK依次活化下游靶點(diǎn)eIF2α和ATF4，最終激活凋亡因子CHOP，CHOP下調(diào)Bcl-2/Bax，上調(diào)caspase-3介導(dǎo)凋亡[13，14]。既往研究中，吸煙誘導(dǎo)的IDD患者NP細(xì)胞中GRP78、CHOP上調(diào)，ERS水平及凋亡率增加，經(jīng)4-PBA處理后凋亡減輕；足細(xì)胞發(fā)生ERS時Mfn2顯著下調(diào)；敲除Mfn2能誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞發(fā)生ERS，提示Mfn2直接參與ERS調(diào)節(jié)過程，上調(diào)Mfn2或能阻遏ERS凋亡[15～17]。本研究發(fā)現(xiàn)在退變NP細(xì)胞中，過表達(dá)Mfn2可抑制PERK和eIF2α激活，阻遏PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路活化，與ERS特異性阻斷劑4-PBA具相似效應(yīng)，同時凋亡率下降，提示Mfn2可通過抑制ERS凋亡保護(hù)NP細(xì)胞。

本研究通過CO-IP證實(shí)了NP細(xì)胞中Mfn2與PERK存在相互作用關(guān)系，且過表達(dá)Mfn2后，NP細(xì)胞中PERK mRNA及蛋白水平下調(diào)，同時PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路被抑制，凋亡率下降。Mfn2可與PERK形成物理連接并抑制其功能，對調(diào)節(jié)PERK通路活化起關(guān)鍵作用，缺乏Mfn2時PERK會持續(xù)活化誘導(dǎo)ERS發(fā)生，表明Mfn2可通過直接靶向PERK調(diào)控PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路抑制ERS凋亡[18]。另外，筆者也嘗試采用siRNA干擾技術(shù)以抑表達(dá)Mfn2，進(jìn)一步證實(shí)Mfn2對NP細(xì)胞ERS的調(diào)控，但轉(zhuǎn)染的效果及Mfn2蛋白表達(dá)結(jié)果不甚理想，筆者推測這可能與原代細(xì)胞狀態(tài)及轉(zhuǎn)染方法有較大關(guān)系，也可能與Mfn2對細(xì)胞生理過程的調(diào)控有關(guān)，這將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。近年來研究證實(shí)，上調(diào)Mfn2可阻遏線粒體自噬途徑抑制NP細(xì)胞凋亡；抑制ERS可阻礙NP細(xì)胞自噬活化；抑制自噬可減輕NP細(xì)胞凋亡[6，19，20]。結(jié)合本研究中過表達(dá)Mfn2抑制ERS減輕退變NP細(xì)胞凋亡，筆者推測Mfn2或通過PERK介導(dǎo)ERS影響自噬進(jìn)而調(diào)控線粒體-凋亡途徑。

綜上所述，上調(diào)Mfn2可抑制退變大鼠NP細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路，阻滯ERS，下調(diào)Bax、caspase-3，上調(diào)Bcl-2有關(guān)，而該過程中Mfn2是否還參與調(diào)控線粒體自噬機(jī)制待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯現(xiàn)出Mfn2抑制凋亡減輕NP細(xì)胞退變方面的巨大潛力，其可能是治療IDD潛在新靶點(diǎn)。