玉竹多糖對酒精誘導(dǎo)的Hep G2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制*

朱 琪，吳雅雯，王曉慧，李庚喜

（湘西南中藥開發(fā)利用湖南省工程研究中心，邵陽學(xué)院，邵陽 422000）

過量飲酒導(dǎo)致的酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）已成為全球性的醫(yī)療保健問題［1］。研究表明，酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭和促炎細(xì)胞因子在ALD的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用［2，3］。此外，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的增加促進(jìn)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的形成。而MDA沉積又可刺激炎性細(xì)胞因子的分泌，加速受損肝組織的病變［4］。核因子E2相關(guān)因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是一種與氧化還原失衡相關(guān)的敏感轉(zhuǎn)錄因子［5，6］。在應(yīng)激條件下，過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）破壞胞漿蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）-Nrf2的相互作用，啟動Nrf2的有效核轉(zhuǎn)位，提高抗氧化酶活性，抵御有害刺激產(chǎn)生的不利影響［7］。這提示作為機(jī)體內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化Nrf2/Keap1通路可為抗酒精性肝毒性的治療提供策略［8］。

目前針對ALD患者一般干預(yù)措施包括肝病并發(fā)癥住院管理、酒精戒斷管理、感染監(jiān)測和早期有效的抗生素治療以及營養(yǎng)補(bǔ)充，其中實(shí)施戒酒管理或早期營養(yǎng)補(bǔ)充可能是早期抵御ALD病變發(fā)展的有效措施［1，9］。來源于天然產(chǎn)物的多糖是一類已被證實(shí)具有抗氧化、調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)和抑制細(xì)胞凋亡等活性，兼具高效、無毒或低副作用等優(yōu)點(diǎn)的潛在抵御酒精性肝損傷保健功能食品或藥物制劑資源［10，11］。玉竹多糖（Polygonatum odoratum polysaccharides，POP）是來源于藥膳同源植物玉竹［Polygonatum odoratum（Mill.）Druce］干燥根莖中的活性成分。最新的玉竹研究發(fā)現(xiàn)，玉竹多糖在體外可以清除自由基，在體內(nèi)可以提高機(jī)體抗氧化酶活性、抑制炎性因子和MDA的含量［12，13］。這些活性都有助于肝細(xì)胞抵御酒精脅迫所產(chǎn)生的逆應(yīng)激，但目前缺乏相關(guān)的實(shí)驗研究。因此，本研究通過Nrf2/Keap1抗氧化信號通路檢測玉竹多糖對酒精誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞（HepG2）氧化應(yīng)激、GSH耗竭、炎癥因子以及細(xì)胞凋亡水平的影響，探討玉竹多糖對酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

玉竹多糖購自蘭州沃特萊斯科技有限公司（批號：WTLS-010），采用苯酚-硫酸法測定玉竹多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)58%；95%醫(yī)用酒精（批號：20210207）購于潤玲科技集團(tuán)有限公司；人源性肝細(xì)胞系（HepG2；批號：CX0004），HepG2細(xì)胞專用培養(yǎng)基（批號：ZYPYG0004），3-（4，5-二甲基-噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化銨（MTT）試劑（批號：AR1156）購于武漢博士德生物公司；ROS（批號：E004-1-1）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT，批號：C009-3-1）、MDA（批號：A003-2-1）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST，批號：C010-3-1）和GSH（批號：A006-1-1）等生化試劑盒購于南京建成生物工程研究所；白介素-1β（IL-1β，批號：CSB-E08053h）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號：CSB-E09315h）購于武漢華美生物工程有限公司；RIPA裂解液（批號：P0013E）和硝酸纖維素膜（批號：FFN02）購于碧云天生物技術(shù)公司；10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠（批號：MA0159）購于大連美侖生物技術(shù)公司；ECL顯色液（批號：K-12045-D50，美國advansta），Keap1（批號：ab119403，英 國abcam）、p-Nrf2（批 號：ab237464，英國abcam）、磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶-1（NQO1，批號：ab97385，英國abcam）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax，批號：ab182733，英國abcam）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2，批號：ab196495，英國abcam）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleavedcaspase-3，批號：ab2302，英國abcam）等抗體由邵陽杏匯科技有限公司代購。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

EPOCH-2多功能酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；5810型臺式冷凍離心機(jī)（德國Eppndorf公司）；LRH-500細(xì)胞生化培養(yǎng)箱（上海篤特科學(xué)儀器有限公司）；FluorChem FC2化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（南京非同科學(xué)儀器有限公司）；電泳槽（北京龍方科技有限公司）；電子天平（梅特勒托利多科技（中國）有限公司）。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和處理以及細(xì)胞存活率檢測

參閱文獻(xiàn)［14］，HepG2肝細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。實(shí)驗分為空白組、不同濃度（3%、4%、5%和6%）酒精組和不同濃度（100μg/L、200 μg/L、400μg/L和600μg/L）玉竹多糖處理組，每組設(shè)3復(fù)孔，24 h后加入MTT試劑，37℃孵育4 h，抽提培養(yǎng)液。用DMSO溶解紫甲瓚晶體后，于550nm處測量吸收強(qiáng)度。采用MTT法計算HepG2細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=A（處理組）/A（對照組）×100%。

1.3 玉竹多糖的干預(yù)對酒精誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞存活率的影響

96孔板上培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞分別用不同濃度（100μg/L、200μg/L、400μg/L和600μg/L）的玉竹多糖預(yù)處理1 h，并設(shè)未處理的空白組，再用1.2步驟選用的酒精濃度處理24 h，計算細(xì)胞存活率。

1.4 細(xì)胞內(nèi)ALT和AST活性

參閱試劑盒廠家說明書，測定HepG2細(xì)胞內(nèi)ALT和AST活性。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA和GSH水平

參閱試劑盒廠家說明書，測定HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA和GSH水平。

1.6 細(xì)胞內(nèi)IL-1β和TNF-α水平

用酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒評估HepG2細(xì)胞內(nèi)IL-1β和TNF-α水平。

1.7 Western Blot分析

用RIPA裂解液提取細(xì)胞裂解產(chǎn)物，測定蛋白濃度。參閱文獻(xiàn)［15］，將蛋白質(zhì)用SDS-PAGE凝膠上樣，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用5%脫脂牛奶在磷酸鹽吐溫緩沖液中封閉膜，將膜與磷酸鹽吐溫緩沖液中的一抗孵育過夜，洗膜后，經(jīng)辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗體孵育，ECL孵育顯色后，暗盒內(nèi)固定顯影，于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察目標(biāo)蛋白表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同處理方式下Hep G2細(xì)胞的存活率

不同濃度的酒精處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞存活率呈劑量依賴性下降，與空白組比較，3%濃度的酒精即可顯著影響HepG2細(xì)胞存活率為90.33%±2.52%（P＜0.05）。其中4%濃度的酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞生存率在77.33%±6.43%左右，且與空白組比較具有極顯著性（P＜0.01），因此在所有后續(xù)實(shí)驗中都使用4%的酒精濃度。同時加入不同濃度（100μg/L、200μg/L、400μg/L和600μg/L）的玉竹多糖，并設(shè)未處理的空白組。24 h后，測試結(jié)果顯示，600μg/L以內(nèi)濃度的玉竹多糖均不影響HepG2細(xì)胞的存活率（P＞0.05）。與4%酒精誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞對照組相比，預(yù)先給予玉竹多糖（200 μg/L、400μg/L和600μg/L）預(yù)處理的細(xì)胞存活率分別為（86.67±2.52）%、（89.67±2.52）%和（97.67±2.08）%，可顯著降低4%酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性（P＜0.05），提示玉竹多糖對酒精性肝損傷有保護(hù)作用。且隨著玉竹濃度增加，細(xì)胞存活率明顯提高。雖然100μg/L玉竹多糖可提高4%乙醇誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的存活率，細(xì)胞存活率為（82.00±2.65）%，無明顯影響（P＞0.05）。因此，后續(xù)實(shí)驗中都使用200μg/L、400μg/L和600μg/L玉竹多糖預(yù)處理，進(jìn)一步研究不同濃度的玉竹多糖對酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞生化指數(shù)的影響。

2.2 玉竹多糖對酒精處理Hep G2細(xì)胞ALT和AST活性的影響

如表1所示，4%酒精處理后的HepG2細(xì)胞與空白組相比，可顯著地誘導(dǎo)ALT和AST滲漏（P＜0.01），而不同濃度玉竹多糖的預(yù)處理能顯著降低4%酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的ALT和AST釋放（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.1 Effects of POP on alcohol-induced ALT and AST production in HepG2 cells（mU/ml，±s，n=3）

Tab.1 Effects of POP on alcohol-induced ALT and AST production in HepG2 cells（mU/ml，±s，n=3）

#P＜0.05，##P＜0.01 vs the untreated blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group treated with 4%ethanol

Group AST ALT Blank group 3.68±0.04 1.79±0.07 4%ethanol 4.83±0.03## 2.72±0.03##200μg/LPOP+4%ethanol 4.71±0.02** 2.55±0.06*400μg/LPOP+4%ethanol 4.55±0.03** 2.27±0.02**600μg/LPOP+4%ethanol 4.18±0.02** 2.02±0.05**

2.3 玉竹多糖對酒精處理Hep G2細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響

如表2所示，4%酒精處理的HepG2細(xì)胞與空白組相比，顯著誘導(dǎo)ROS上升（P＜0.01），而玉竹多糖的預(yù)處理能顯著降低4%酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平（P＜0.01）。此外，玉竹多糖可有效抑制4%酒精誘導(dǎo)的肝HepG2細(xì)胞MDA水平（P＜0.05），顯著提高4%酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH水平（P＜0.01）。

Tab.2 Effects of POP on alcohol-induced oxidative stress in HepG2 cells（±s，n=3）

Tab.2 Effects of POP on alcohol-induced oxidative stress in HepG2 cells（±s，n=3）

#P＜0.05，##P＜0.01 vs the untreated blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group treated with 4%ethanol

Group ROS（%）MDA（nmol/mg prot）GSH（nmol/mg prot）Blank group 100.00±0.03 0.16±0.01 8.83±1.10 4%ethanol 167.33±18.15##0.35±0.03##2.59±0.14##200μg/LPOP+4%ethanol 149.00±14.11 0.32±0.03 4.59±0.17**400μg/LPOP+4%ethanol 126.33±9.45**0.26±0.02* 6.73±0.39**600μg/LPOP+4%ethanol 121.00±8.72**0.21±0.01**7.52±0.66**

2.4 玉竹多糖對酒精處理Hep G2細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響

結(jié)果表明（表3），與空白組相比，4%酒精處理顯著增加HepG2細(xì)胞內(nèi)IL-1β和TNF-α的生成量（P＜0.01），而200μg/L玉竹多糖的預(yù)處理即可顯著減少4%酒精誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中促炎因子IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生（P＜0.05）。

Tab.3 Effects of POP on the contents of IL-1βand TNF-α in HepG2 cells induced by alcohol（pg/ml，±s，n=3）

Tab.3 Effects of POP on the contents of IL-1βand TNF-α in HepG2 cells induced by alcohol（pg/ml，±s，n=3）

#P＜0.05，##P＜0.01 vs the untreated blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group treated with 4%ethanol

Group IL-1β TNF-α Blank group 31.75±1.36 316.23±13.93 4%ethanol 82.07±2.67## 827.63±25.71##200μg/L POP+4%ethanol 73.45±5.90* 765.73±36.69*400μg/L POP+4%ethanol 61.61±2.70** 669.30±14.98**600μg/L POP+4%ethanol 50.11±3.89** 544.77±27.42**

2.5 玉竹多糖對酒精處理Hep G2細(xì)胞相關(guān)信號通路的調(diào)控

如圖1、表4和表5所示，4%酒精處理的HepG2細(xì)胞與空白組相比，顯著地上調(diào)Keap1和cleaved-caspase-3的蛋白表達(dá)水平以及Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比率水平（P＜0.01），而玉竹多糖的預(yù)處理能顯著降低4%酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)Keap1和cleaved-caspase-3的蛋白表達(dá)水平以及Bax/Bcl-2蛋白指數(shù)（P＜0.05）。此外，玉竹多糖有效抵御4%酒精誘導(dǎo)的肝HepG2細(xì)胞p-Nrf2和NQO-1水平下降（P＜0.05）。

Fig.1 Effects of POP on the expressions of Keap1，p-Nrf2，NQO-1，Bax，Bcl-2 and cleaved-caspase-3 in HepG2 cells induced by alcohol（±s，n=3）

Tab.4 Relative expression levels of Keap1，p-NrF2 and NQO-1，Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in HepG2 cells（±s，n=3）

Tab.4 Relative expression levels of Keap1，p-NrF2 and NQO-1，Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in HepG2 cells（±s，n=3）

#P＜0.05，##P＜0.01 vs the untreated blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group treated with 4%ethanol

Group Keap1 p-Nrf2 NQO-1 Blank group 0.16±0.04 0.40±0.12 0.49±0.03 4%ethanol 0.47±0.06##0.22±0.08#0.04±0.01##200μg/LPOP+4%ethanol 0.38±0.05 0.32±0.02 0.08±0.03 400μg/LPOP+4%ethanol 0.25±0.03**0.50±0.03**0.32±0.04**600μg/LPOP+4%ethanol 0.23±0.03**0.55±0.04**0.29±0.03**

Tab.5 Relative expression levels of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in HepG2 cells（±s，n=3）

Tab.5 Relative expression levels of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in HepG2 cells（±s，n=3）

#P＜0.05，##P＜0.01 vs the untreated blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group treated with 4%ethanol

Group Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 cleaved-caspase-3 Blank group 0.08±0.03 0.33±0.02 0.23±0.08 0.06±0.02 4%ethanol 0.36±0.01## 0.10±0.04## 3.50±0.78## 0.22±0.04##200μg/LPOP+4%ethanol 0.30±0.03* 0.15±0.04 2.25±0.46* 0.18±0.03 400μg/LPOP+4%ethanol 0.24±0.02** 0.20±0.04 1.70±0.24** 0.14±0.02*600μg/LPOP+4%ethanol 0.17±0.02** 0.24±0.06* 1.53±0.18** 0.12±0.02**

3 討論

在ALD的發(fā)病機(jī)制中，酒精誘導(dǎo)的氧化脅迫會促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)的ROS升高［1，9］。細(xì)胞內(nèi)自由基的過度累積可以引發(fā)細(xì)胞膜中脂質(zhì)的氧化，導(dǎo)致MDA的升高［2，4］。肝細(xì)胞中MDA水平反映酒精誘導(dǎo)的肝損傷中的脂質(zhì)過氧化程度。抗氧化劑包括酶促和非酶促抗氧化劑，其中細(xì)胞內(nèi)清除ROS的非酶抗氧化劑防御主要通過非酶抗氧化劑實(shí)現(xiàn)［16］。而非酶促抗氧化劑GSH是哺乳動物中含量最豐富的非蛋白硫醇，人類早已認(rèn)識其在解毒和抵御氧化劑方面的核心作用［14］。酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞會耗盡有助于細(xì)胞內(nèi)抗氧化的GSH水平［17，18］。因此，通過檢測培養(yǎng)基中HepG2細(xì)胞的ROS、MDA和GSH的含量可考察玉竹多糖對酒精處理HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。而氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［5］。在酒精介導(dǎo)的肝臟損傷過程中，較高的ROS和MDA水平可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子如IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生，并參與急性酒精性肝損傷［19］。因此，抑制炎癥也是治療慢性酒精肝損傷的方案之一［20］。以IL-1β和TNF-α水平為指標(biāo)，我們考察了玉竹多糖對酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的影響。而AST和ALT活性被公認(rèn)為是酒精性肝細(xì)胞損傷的可靠和敏感的生理標(biāo)志物［21］。我們的實(shí)驗結(jié)果表明，玉竹多糖不僅抑制酒精誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷，還可以抑制炎性因子水平的上升，保護(hù)肝細(xì)胞。

Nrf2是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控氧化還原平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)細(xì)胞暴露在與氧化應(yīng)激相關(guān)的因素（如ROS）中時，Nrf2會從Nrf2/Keap1復(fù)合體中釋放出來，磷酸化后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中啟動抗氧化酶磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶-1（NADPH quinineoxidoreductase-1，NQO-1）等的抗氧化毒性［7］。有報道稱，Nrf2/Keap1通路在阻止ALD發(fā)生的防御系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用［22］。在本研究中，通過檢測Nrf2核轉(zhuǎn)位和Keap1水平，研究玉竹多糖對Nrf2/Keap1信號通路激活的影響。結(jié)果表明，與酒精處理的細(xì)胞相比，玉竹多糖的預(yù)處理顯著提高細(xì)胞質(zhì)中Keap1和細(xì)胞核中p-Nrf2和NQO-1的蛋白表達(dá)水平。這提示，Nrf2/Keap1途徑的激活可能是玉竹多糖抗酒精肝損傷的細(xì)胞保護(hù)作用的潛在途徑之一。大量研究表明，酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激有關(guān)，添加抗氧化劑對酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用［19］。已有研究證實(shí)，Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的重要蛋白，抑制cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)和下調(diào)Bax/Bcl-2比率可抑制細(xì)胞的非正常凋亡［23］。實(shí)驗結(jié)果顯示，與酒精處理的細(xì)胞相比，玉竹多糖的預(yù)處理也顯著下調(diào)cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)和Bax/Bcl-2指數(shù)，這表明玉竹多糖能減輕酒精誘導(dǎo)的氧化損傷所致細(xì)胞凋亡和肝毒性。

綜上，玉竹多糖能夠減少酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞應(yīng)激損傷的同時抑制促炎因子的釋放，保護(hù)肝細(xì)胞，其機(jī)制可能與玉竹多糖能激活Nrf2/Keap1信號通路，Nrf2磷酸化核轉(zhuǎn)位后上調(diào)NQO-1蛋白表達(dá)，使HepG2細(xì)胞免受酒精誘導(dǎo)的氧化損傷的同時還減輕炎性反應(yīng)，進(jìn)而下調(diào)Bax/Bcl-2指數(shù)和cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)，抵御細(xì)胞凋亡。然而Nrf2/Keap1通路是否是玉竹多糖調(diào)節(jié)減輕酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷的唯一機(jī)制還待進(jìn)一步實(shí)驗驗證。我們將在今后結(jié)合動物實(shí)驗、基因組學(xué)和代謝組學(xué)等實(shí)驗技術(shù)進(jìn)一步探討基于Nrf2/Keap1信號通路保護(hù)酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，防治ALD的作用機(jī)制。