腺苷A1受體激動劑預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后HIF-1α及GPx1的影響

郭哨愷，陰雪妍，譚軍，王露露，高振華，李明

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)二科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

缺血性腦血管病的特點為發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高。早期治療是改善預后，降低患者致死風險的關(guān)鍵。常用治療方法為溶栓、血管內(nèi)介入等。但上述治療過程可能造成的腦缺血再灌注損傷(CIRI)也攜帶一定治療風險?，F(xiàn)階段，藥物預處理可有效改善腦缺血再灌注損傷，改善臨床結(jié)局，促進患者預后轉(zhuǎn)歸。而具體治療方向上臨床以抗應激與抗炎癥等為主，如相關(guān)指標低氧誘導因子-1α(HIF-1α)可通過調(diào)節(jié)能量代謝、抗氧化應激、抑制炎癥因子的釋放等一系列作用達到改善CIRI目的。另外，谷胱甘肽過氧化物酶1(GPx1)可通過抗氧化應激途徑改善CIRI?；谝陨蟽身椫笜藢τ谌毖阅X血管病CIRI的重要影響，本實驗針對健康雄性SD大鼠為例，制作大腦中動脈栓塞(MCAO)動物模型，探究腺苷A1受體激動劑環(huán)己基腺苷(CHA)預處理的作用價值，以及明確其與HIF-1α、GPx1之間的相關(guān)性，旨在為后續(xù)相關(guān)報道的順利開展提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇新鄉(xiāng)醫(yī)學院健康的SD雄性大鼠為研究對象，均來自新鄉(xiāng)醫(yī)學院，共60只，周齡區(qū)間7～9周，質(zhì)量區(qū)間250～350 g，所處的飼養(yǎng)環(huán)境通風良好，且溫度適宜。本研究經(jīng)河南省新鄉(xiāng)市新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院醫(yī)學研究倫理委員會批準[新醫(yī)三附院倫審(K2019-006-01)號]，并嚴格遵守動物實驗3R原則。

1.2 主要實驗試劑及儀器

實驗試劑：谷胱甘肽過氧化物酶1抗體(常州市祥泰生物技術(shù)有限公司)、環(huán)己基腺苷(上海源葉生物科技有限公司)、DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、HIF-1α多克隆抗體(北京索萊寶科技有限公司)等。

儀器：Nikon MODEL YS100顯微鏡(Nikon公司)、United Imaging MR770 MR3.0T超導MRI系統(tǒng)(上海聯(lián)影醫(yī)療科技有限公司)、WCC02大鼠磁共振線圈(上海聯(lián)影醫(yī)療科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及建模

分組：共60只健康雄性SD大鼠隨機分為以下3組：假手術(shù)組(F組，N=20只)、缺血再灌注組(IR組，N=20只)、CHA預處理組(AP組，N=20只)，在此基礎(chǔ)上，參照缺血再灌注時間(2 h、6 h、24 h、48 h)，將各組分為4個亞組，各組5只。

建模：(1)于術(shù)前3 d，在同一時間點取0.9%氯化鈉注射液2 mg注入F組、IR組。而AP組則注入0.9%氯化鈉注射液2 mL+160 μg/kg CHA注射液。(2)在此基礎(chǔ)上，依照線栓法，IR組、AP組制備大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，術(shù)前常規(guī)禁食、水12 h。(3)腹腔麻醉，即于頸正中皮膚取一切口，逐層切開其皮膚組織，充分顯露左側(cè)頸動脈，包括頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈 (ICA)、頸總動脈(CCA)。(4)從分叉根部結(jié)扎ECA，CCA遠離分叉處結(jié)扎，ICA動脈夾夾閉，確定線栓插口的位置(分叉下方4 mm處左右)，插入深度為18 mm左右，直至進入大腦的前動脈，對其中動脈的血流進行阻斷。(5)標記線拴尾端，常規(guī)縫合，切口均勻涂抹適量紅霉素軟膏，腹腔注入0.9%氯化鈉注射液2 mL，注意在整個操作過程中做好保溫工作(以白熾燈照射為主)。(6)2 h后拔出線栓1 cm左右，可見大腦中動脈血供恢復至正常。(7)術(shù)后將各組大鼠分別進行單籠飼養(yǎng)，確定無異常即可恢復正常飲食水。

F組的操作與IR相同，但術(shù)中無線栓相關(guān)操作。

1.3.2 頭顱MRI檢查

48 h時，各組進行頭顱MRI檢查，如下：大鼠麻醉，確定麻醉起效后頭置于線圈中央，進行T1WI、T2WI像常規(guī)掃描，以快速自旋回波序列為主，參數(shù)設(shè)為TE、TR分 別 為102.24 ms、3 300 ms、掃 描6 min、層 厚2 mm、激勵層數(shù)3、層間距2 mm、視野及矩陣分別為35 mm×35 mm、矩陣208×216；獲取梗死灶各層面圖像，將其輸送至處理站，經(jīng)image pro plus 6.0圖像處理軟件計算。

1.3.3 HE染色

48 h時，各組置入4%多聚甲醛內(nèi)，固定24 h后取視交叉前后腦組織，厚度為2 mm，置入包埋盒內(nèi)進行脫水、石蠟包埋處理，最終制成厚度為4 μm的切片，依照HE染色標準化流程，將其制作標本，在光學顯微鏡下進行觀察，采集圖片。

1.3.4 HIF-1α及GPx1免疫組化染色方法

各組按時間點取出大腦至培養(yǎng)皿中，切取視交叉前后各腦組織，厚度為2 mm，進行處理，最后完成HIF-1、GPx1免疫組化檢測。烤片后晾至室溫，二甲苯去蠟，酒精脫二甲苯，在高壓鍋中行酸性修復液修復，3%的HO孵育，山羊抗兔SABC免疫組化試劑中的A液孵育，按照一定比例加入兔抗大鼠多克隆HIF-1α抗體、兔抗大鼠GPx1多克隆抗體，在4℃條件下后過夜，B液、C液孵育，DAB顯色，染色程度由顯微鏡鏡下控制。之后繼續(xù)使用蘇木素、鹽酸酒精、梯度酒精、二甲苯分別進行復染、分化、脫水、透明，最后使用中性樹膠進行封片，在光鏡作用下進行觀察，視情況采集圖片，注意各切片需要隨機取8個400倍的視野，對各視野HIF-α抗體、GPx1的積分光密度值進行計算，工具為圖像處理軟件，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學方法

選擇SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，變量資料行單因素方差分析，用檢驗。以檢驗水平α=0.05為標準，＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠頭顱MRI結(jié)果比較

進行頭顱MRI檢查，判斷左側(cè)大腦中動脈供血區(qū)情況，可見F組無異常信號，IR、AP組有異常信號，T1WI圖上存在大片低信號影，T2WI圖上存在大片高信號影。在T2WI圖上，IR組腦梗死體積(168.80±17.58)mm較AP組(57.20±14.45)mm大，差異有統(tǒng)計學意義(=10.966，＜0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠缺血—再灌注損傷48 h后頭顱MRI梗死體積

2.2 三組HE染色結(jié)果比較

HE染色，可見三組在腦缺血再灌注不同時間點的具體表現(xiàn)，即F組在48 h時的神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)基質(zhì)無水腫；IR組2 h、48 h時的神經(jīng)細胞受損嚴重，如皺縮、核固縮、大小不一；AP組2 h、48 h時的神經(jīng)細胞部分核固縮。AP組2 h、48 h的神經(jīng)細胞受損程度較IR組輕。見圖2。

圖2 為各組大鼠腦缺血—再灌注損傷后48 h腦組織HE染色(×400)

2.3 三組HIF-1α蛋白表達情況比較

與F組大鼠對比，其他組大鼠在6 h、24 h、48 h的HIF-1α蛋白表達水平相對較高，差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)；而AP組 大 鼠 在6 h、24 h、48 h的HIF-1α蛋白表達水平均高于IR組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)；三組大鼠之間2 h HIF-1α蛋白表達水平對比差異無統(tǒng)計學意義(＞0.05)。見表1及圖3。

表1 三組HIF-1α蛋白表達情況比較(± s )

圖3 大鼠腦缺血再灌注48 h后F組、IR組、AP組腦組織HIF-1α表達情況(免疫組化法，×400)

2.4 三組GPx1蛋白表達情況比較

F組GPx1蛋白呈高表達，各亞組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(＞0.05)；2 h時，IR組、AP組的GPx1蛋白表達呈下降趨勢發(fā)展，24 h降至最低，48 h有所升高，各時間點的GPx1蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。與F組比較，AP組、IR組在2 h、6 h、24 h、48 h的GPx1蛋白呈低表達，差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。與IR組比較，AP組6 h、24 h、48 h的GPx1蛋白呈高表達，差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。見表2及圖4。

表2 三組GPx1蛋白表達情況比較(X ±s)

圖4 大鼠腦缺血再灌注48 h后F組、IR組、AP組腦組織GPx1表達情況(免疫組化法，×400)

3 討 論

腦缺血再灌注損傷與多種因素相關(guān)，如自由基、細胞內(nèi)鈣含量超常、興奮性氨基酸毒性等。急性局灶性腦缺血所引發(fā)的缺血中心區(qū)死亡主要為細胞壞死，現(xiàn)階段已經(jīng)明確的是，缺血發(fā)生后7 min內(nèi)，細胞能量可逐漸消耗殆盡，同時膜電位下降，經(jīng)興奮谷氨酸受體導致細胞膜Ca通道開放，造成膜結(jié)構(gòu)與DNA損傷。關(guān)于腦缺血再灌注損傷的治療，以抑制炎癥級聯(lián)反應、阻斷細胞凋亡為主。目前，藥物預處理在臨床較為常用，如腺苷A1受體激動劑CPA、ATP敏感性鉀通道開放劑KCO、降鈣素基因相關(guān)肽等。既往有資料顯示，醫(yī)護人員通過短暫缺血預處理后，患者CA1區(qū)表達顯著升高，同時神經(jīng)細胞存活數(shù)目也較多。除以上預處理方法之外，缺血性神經(jīng)保護藥物在現(xiàn)代臨床應用廣泛。如鈣拮抗劑中的二氫砒啶類藥物，尤以尼莫地平為主，這屬于特異性阻滯L型鈣通道。NMDA受體阻滯劑中，競爭性NMDA受體拮抗劑的磷酸鹽等。AMPA受體拮抗劑，可預防鈉進入細胞，同時也可預防細胞去極化及其引發(fā)的改超載情況。

3.1 腺苷A1受體激動劑預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用

目前，已有多項研究指出藥物預處理可通過藥物激發(fā)內(nèi)源性神經(jīng)保護因子作用，達到神經(jīng)保護的目的。根據(jù)CHA預處理后大鼠CIRI 48 h組HE染色的結(jié)果，分析可以得出AP組大鼠腦組織神經(jīng)細胞損傷程度較IR組明顯減輕，大鼠頭顱MRI F組無梗死灶，而AP組梗死灶體積較IR組明顯縮小，差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。此結(jié)果代表，CHA預處理更有助于降低梗死程度，對于急性缺血性再灌注損傷具有重要意義。而其中腺苷A1受體激動劑預處理可減輕再灌注損傷，此結(jié)果可指導促進今后相關(guān)治療(溶栓、血管內(nèi)介入等)的進一步發(fā)展，還可為部分缺血再灌注的神經(jīng)外科手術(shù)患者是否使用前腺苷A1受體激動劑預處理提供指導建議，以保證治療效果，改善臨床結(jié)局，降低致殘率。

3.2 腺苷A1受體激動劑預處理發(fā)揮腦保護作用的機制

上調(diào)HIF-1α蛋白的表達：本研究指出，低氧條件下HIF-1α的增加可促進缺血半暗帶的再灌注，解除患者腦水腫狀態(tài)，保護其腦神經(jīng)?？紤]與調(diào)節(jié)下游靶基因表達有關(guān)，機制如下：(1)上調(diào)血紅素加氧酶1抗氧化酶水平，提高自由基清除率，減少損害程度。(2)促進抗凋亡因子的高表達，以及阻斷促凋亡因子的表達。(3)可誘導糖酵解相關(guān)酶類的表達，調(diào)節(jié)腦組織能量代謝。由此可見，HIF-1α作為CRIR的治療靶點具有一定的優(yōu)勢。本實驗指出CHA預處理提高HIF-1α蛋白的高表達。IR組、AP組在2 h時的HIF-1α蛋白增高，24 h達到高峰，48 h有所下降，該結(jié)果表示環(huán)己基腺苷預處理的作用效果較顯著，尤其是在促進受損神經(jīng)細胞的修復方面，但是對其缺氧狀態(tài)改善所需時間的減短無作用。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合HIF-1α的腦保護作用，推測腺苷A1受體激動劑的使用具有良好的作用效果，改善再灌注損傷，保護腦神經(jīng)阻滯，與上調(diào)HIF-1α蛋白表達密切不可分。

本研究發(fā)現(xiàn)，與缺血再灌注比較，CHA預處理后GPx1蛋白在2 h、6 h、24 h、48 h的表達均增高，這無疑為機體對抗氧自由基損傷提供了更多保障。GPx1蛋白主要生理功能是作為生物酶催化谷胱甘肽(GSH)清除人體細胞胞質(zhì)、胞膜和胞外的過氧化氫、脂質(zhì)過氧化物和有機過氧化物等有害代謝產(chǎn)物。腺苷A1受體激動劑更有利于減輕再灌注損傷，避免功能障礙的發(fā)生，促進預后轉(zhuǎn)歸，考慮與上調(diào)GPx1蛋白高表達密切相關(guān)。

經(jīng)上述結(jié)果分析，認為缺血再灌注組24 h的HIF-1α、GPx1蛋白達到高峰，24 h以內(nèi)進行藥物治療可在一定程度上將腦缺血再灌注損傷程度降至最低，以獲取更理想的臨床療效。HIF信號級聯(lián)反應會受到缺氧狀態(tài)的影響，在缺氧狀態(tài)下，通常會讓細胞持續(xù)的細胞分化。HIF-1α在缺血再灌注早期基于缺血或損傷可致水平快速升高，而用藥治療后基于損傷減輕促使其水平明顯改變。

綜上所述，再灌注損傷發(fā)生后的24 h以內(nèi)可作為最佳治療時間窗，此階段采取腺苷A1受體激動劑CHA預處理，可保護患者腦組織神經(jīng)，考慮到其與調(diào)節(jié)HIF-1α、GPx1蛋白的高表達有關(guān)，為此本研究認為在預處理血管再通后24 h內(nèi)重復給藥是十分重要的，可減輕患者神經(jīng)功能的缺損程度，促進其預后恢復。