亞砷酸鈉對NE-4C細胞增殖、遷移及凋亡的影響

申晨晨 熊昊杰 馬 艷

砷是存在于地殼中的有毒類金屬元素，廣泛分布于自然界中，是一種環(huán)境毒物和致癌物。長期砷暴露會導致皮膚、肝臟、膀胱、腎臟和肺部癌癥以及心血管系統(tǒng)和神經組織的病變。大量文獻已證實無機砷是一種神經毒物，可導致人或動物行為改變，神經系統(tǒng)發(fā)育異常，神經元形態(tài)學變化、凋亡和壞死等。神經細胞不易再生且對有毒物質十分敏感，因此砷對神經系統(tǒng)的毒性研究尤為重要。神經干細胞的增殖和分化與神經發(fā)育密切相關，砷作為一種神經毒物會如何影響神經干細胞的增殖、遷移與凋亡目前還不清楚。本研究通過觀察NaAsO對小鼠神經干細胞(NE-4C細胞)增殖、遷移、凋亡及活性氧生成水平的影響，探討砷導致神經干細胞損傷的可能作用機制。

材料與方法

1.細胞株：小鼠神經干細胞(NE-4C細胞)購自廣州吉妮歐公司。

2.試劑與儀器：胎牛血清(FBS)、MEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合液、PBS緩沖液和0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；谷氨酰胺購自以色列BI公司；亞砷酸鈉(NaAsO，分析純)購自北京化學試劑三廠；CCK-8試劑、Hoechst 33342染色試劑、細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、結晶紫、GAPDH購自北京索萊寶公司；caspase-12購自英國Abcam公司；葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)、anti-rabbit IgG-HRP購自美國CST公司。高速離心機購自美國Sigma公司；熒光倒置顯微鏡購自中國麥克迪奧公司；超凈工作臺、酶標儀購自美國Thermo公司；激光共聚焦顯微鏡購自日本Nikon公司；電泳儀購自美國Bio-Rad公司；化學發(fā)光凝膠成像儀購自美國Protein Simple公司。

3.細胞培養(yǎng)及分組：NE-4C細胞于高糖MEM培養(yǎng)基(含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、1%谷氨酰胺)，37℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期NE-4C細胞開展實驗，分為對照組及NaAsO處理組，其中NaAsO處理組分別用0.4、0.8、1.6、2.4、3.2μmol/L NaAsO處理，細胞計數(shù)后取合適密度進行鋪板，細胞貼壁后NaAsO干預，活性氧指標干預6h，其余實驗干預24h進行后續(xù)實驗。

4.CCK-8法檢測細胞增殖指標：取干預后96孔板細胞，每孔加入10μl CCK-8試劑于培養(yǎng)箱中孵育2h，用酶標儀在450nm處檢測各孔的值。抑制率(%)=1-(實驗組值-空白組值)/(對照組值-空白組值)×100%。

5.Transwell遷移實驗檢測細胞的遷移能力：取干預后Transwell小室，4%多聚甲醛固定20min，1%結晶紫染色20min，PBS漂洗后棉簽去除小室內細胞，倒置顯微鏡下拍照、計數(shù)。

6.Hoechst 33342熒光染色法檢測細胞凋亡：取干預后6孔板細胞，每孔加入1ml的Hoechst 33342稀釋液(10μg/ml)染色20min，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)學改變；出現(xiàn)細胞核體積縮小、固縮、染色質濃縮或凋亡小體形成則判斷為凋亡細胞。

7.DCFH-DA活性氧熒光探針檢測細胞內活性氧水平：取干預后NE-4C細胞，按照說明書進行熒光探針的裝載以及細胞核染色，共聚焦顯微鏡下拍照，圖片采用Image J處理，以熒光強度代表活性氧含量。

8.Western blot法檢測細胞內蛋白表達水平：取干預后細胞，裂解液冰上裂解30min，取上清蛋白定量及變性，根據(jù)蛋白相對分子質量配置凝膠，樣品按照等體積等濃度上樣，電泳、電轉，5%脫脂奶粉封閉2h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1h，洗膜后ECL發(fā)光試劑顯影，采用Image J對條帶灰度值進行分析。

結 果

1.NaAsO對NE-4C細胞增殖的影響：CCK-8實驗結果顯示，NaAsO對NE-4C細胞的抑制率隨藥物濃度的增加逐漸增加，經過GraphPad分析，NaAsO對NE-4C細胞的 IC為1.786μmol/L，因此NaAsO處理組定為0.4、0.8、1.6、2.4、3.2μmol/L。NaAsO干預24h后，細胞抑制率隨NaAsO濃度升高而升高(=321.6，<0.05，圖1)。

2.NaAsO對NE-4C細胞遷移的影響：Transwell細胞遷移實驗結果顯示了NE-4C細胞在NaAsO作用下遷移能力的變化。如圖所示，NaAsO處理后，NE-4C細胞的遷移能力呈下降趨勢，表現(xiàn)為穿過Transwell小室的細胞隨著NaAsO濃度的升高數(shù)量逐漸減少，2.4及3.2μmol/L NaAsO處理組幾乎沒有細胞穿過小室(=128.2，<0.05，圖2)。

3.NaAsO對NE-4C細胞凋亡的影響：倒置熒光顯微鏡下觀察到Hoechst 33342染色后，對照組的NE-4C細胞染色均勻，細胞核輪廓清晰，呈弱藍色熒光，染色質濃縮現(xiàn)象不明顯；處理組細胞核呈亮藍色熒光，且隨著NaAsO濃度增加，各組的亮藍色熒光逐漸增多，染色質濃縮現(xiàn)象加重，其中3.2μmol/L組由于細胞貼壁能力下降，細胞的數(shù)量減少，但染色質濃縮最嚴重，熒光強度最為明顯，詳見圖3。

4.NaAsO對細胞內活性氧(ROS)水平的影響：用平均熒光強度表示各組細胞的ROS水平，結果發(fā)現(xiàn)，0.4、0.8μmol/L組細胞ROS水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義，之后隨NaAsO濃度的升高細胞內ROS的熒光強度逐漸升高(=57.557，<0.05，圖4)。

5.NaAsO對內質網(wǎng)應激相關蛋白的影響：Western blot法檢測NaAsO對NE-4C細胞內質網(wǎng)應激相關蛋白表達的影響，結果顯示，0.4、0.8、1.6μmol/L組GRP78蛋白表達未見明顯變化，2.4及3.2μmol/L組表達水平升高(=12.484，<0.05，圖5B)；caspase-12蛋白表達水平從1.6μmol/L組開始逐漸升高(=26.283，<0.05，圖5C)；CHOP蛋白表達水平隨干預濃度升高而升高，差異有統(tǒng)計學意義(=18.969，<0.05，圖5D)。

討 論

越來越多的動物和人群研究證據(jù)表明，砷暴露與神經發(fā)育毒性、神經系統(tǒng)并發(fā)癥和認知發(fā)展、學習和記憶損害等方面有關。砷可以通過血-腦脊液屏障，在大腦皮質、海馬區(qū)和基底核等結構中產生的神經毒性；砷也可通過胎盤屏障，直接影響胚胎期大腦的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)神經系統(tǒng)的發(fā)育會被砷影響，可引起神經元細胞、星膠質細胞等神經細胞死亡，但砷對神經干細胞的毒性損傷作用研究較少，本研究從細胞水平探討NaAsO對神經發(fā)育損傷的影響。CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)與其他神經細胞比較，NE-4C細胞對NaAsO的毒性作用更敏感，NaAsO對SH-SY5Y細胞的IC為50μmol/L，對PC12細胞活力造成損傷的最低濃度為40μmol/L，而NaAsO對NE-4C細胞的 IC為1.786μmol/L。較低濃度的NaAsO就會對細胞造成毒性損傷，影響細胞的增殖和遷移能力，使凋亡細胞增多。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)作為細胞內的第二信使可調節(jié)許多信號分子，細胞增殖、凋亡、轉化、衰老等過程的信號通路都可被其影響。正常情況下細胞內ROS的產生與清除是動態(tài)平衡的，當ROS產出大于清除時細胞發(fā)現(xiàn)氧化應激，Ca平衡失調和氧化應激是誘發(fā)內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)的重要因素。Wang等研究發(fā)現(xiàn),砷干預后細胞內ROS水平明顯上升，而加入抗氧化劑則可降低ROS水平，使細胞凋亡率下降。ROS可引發(fā)ERS，持續(xù)的ERS可激活相應的凋亡因子引起細胞凋亡。本研究中，NaAsO干預細胞6h后即可檢測到ROS水平變化，說明ROS的產生是細胞凋亡發(fā)生的早期事件。

引起細胞凋亡的3種途徑中，內質網(wǎng)應激途徑較受關注。內質網(wǎng)應激是通過錯誤折疊或未折疊的蛋白質在內質網(wǎng)的管腔中堆積來表達的，此外，蛋白質合成過多、鈣蓄積、氧化應激、營養(yǎng)缺乏和感染等都會導致內質網(wǎng)應激。輕度ERS對細胞損傷具有保護作用，持續(xù)的ERS可導致細胞死亡。GRP78廣泛分布于內質網(wǎng)中，是ERS的標志性蛋白，其表達水平能夠反映出ERS的發(fā)生、發(fā)展。

CHOP是介導ERS誘導細胞凋亡的特異性轉錄因子，在正常情況下低表達，當ERS時很多信號通路都可誘導CHOP使其表達量增加，參與到下游細胞凋亡途徑。caspase-12是內質網(wǎng)特異性的凋亡效應蛋白，當其被激活時可進一步激活凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3，導致細胞凋亡。Lu等研究發(fā)現(xiàn)，AsO可導致腦神經瘤細胞(neuro-2a)發(fā)生凋亡，使ERS相關分子(GRP78、XBP-1和CHOP) 蛋白以及基因水平的表達上調；有研究發(fā)現(xiàn),NaAsO作用于SH-SY5Y細胞時可使細胞GRP78、CHOP等蛋白的表達水平上調。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，NaAsO可使NE-4C細胞內GRP78、caspase-12、CHOP蛋白表達水平上調，意味著NaAsO可引起NE-4C細胞內質網(wǎng)應激。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)NE-4C細胞對NaAsO較為敏感，較低濃度就可抑制細胞增殖遷移，誘導細胞凋亡，上述實驗結果表明細胞凋亡可能是由于ROS水平增高引起細胞內質網(wǎng)應激誘導的，但內質網(wǎng)應激誘導細胞凋亡的信號機制還需要進一步研究。