下調(diào)晚期糖基化終末產(chǎn)物受體對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移能力的影響*

李海云 楊東光 洪秀麗 李金波 王 輝

（河北省涿州市醫(yī)院普外科，涿州 072750）

乳腺癌屬于一種較為常見(jiàn)的惡性腫瘤，由乳腺上皮細(xì)胞增殖失控引發(fā)惡變所致，目前對(duì)于乳腺癌的具體致病機(jī)制尚不完全明確，因此逆轉(zhuǎn)細(xì)胞增殖、遷移對(duì)提高臨床療效和降低患者死亡率尤為重要。臨床研究表明[3]，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）在惡性腫瘤細(xì)胞增殖、遷移中具有重要的調(diào)控作用。本研究探討下調(diào)RAGE對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移能力的影響，以明確RAGE與乳腺癌惡性轉(zhuǎn)變的關(guān)系，為臨床乳腺癌的診治提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌BT474細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。RAGE siRNA序列的設(shè)計(jì)、合成由上海生工生物工程有限公司完成；PI染液（武漢塞維爾生物科技有限公司）；PI3K抗體、p-PI3K抗體、Akt抗體、p-Akt抗體p-PI3K抗體、兔抗大鼠p-Akt抗體（貝克曼庫(kù)爾特公司）；Bcl-2抗體（Dako公司）；Bax抗體（BD公司）；caspase 3抗體（深圳市豪地華拓生物科技有限公司）。

1.2 人乳腺癌BT474細(xì)胞培育和分組

將人乳腺癌BT474細(xì)胞使用含10%胎牛血清、雙抗的RPMI1640完全培養(yǎng)基在溫度為37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，每3天更換1次新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，行傳代培養(yǎng)，將細(xì)胞分為對(duì)照組（不做任何處理的乳腺癌BT474細(xì)胞）、上調(diào)組（乳腺癌BT474細(xì)胞+RAGE陰性對(duì)照）、下調(diào)組（乳腺癌BT474細(xì)胞+RAGE siRNA）3組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 RAGE siRNA序列的設(shè)計(jì)、合成及細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

根據(jù)基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank查找序列并獲得RAGE序列，使用Ambion公司的在線設(shè)計(jì)軟件，在RAGE序列中獲取特異序列作為干擾靶序列，之后利用BLAST分析序列特異性，根據(jù)siRNA一般設(shè)計(jì)原則，兩端酶切點(diǎn)分別為EcoRⅠ、BamHⅠ，選擇其中1對(duì)序列送至上海生命生物工程有限公司合成。取下調(diào)組、上調(diào)組對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的乳腺癌BT474細(xì)胞鋪于6孔板中，細(xì)胞密度為1×105/mL，在37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h，對(duì)照組不做處理，上調(diào)組轉(zhuǎn)染RAGE mimics上調(diào)載體，下調(diào)組轉(zhuǎn)染RAGE inhibitor下調(diào)載體。RAGE mimics序列：上游引物5'-CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA-3'， 下游引物5'-AGACCGAGACAAGUGCAAUGUU-3'；RAGE inhibitor序列：上游引物5'-UAUUGCACUC GUCCCGGCCUCC-3'， 下游引物5'-AGGCCGGGA CGAGUGCAAUAUU-3'， 在轉(zhuǎn)染過(guò)程中，每組培養(yǎng)基濃度均保持在120 nmol/L。

1.4 RAGE轉(zhuǎn)染效率鑒定

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）法鑒定RAGE轉(zhuǎn)染效率。取各組轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞，提取細(xì)胞中RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得總RNA。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列， RAGE引物序列：上游：5'-CGGCTGGTGTTCCCAATAA-3'，下游：5'-TGTTCCTTCACAGATACTCCCT-3'，內(nèi)參β-actin引物序列：上游：5'-GTTCTTAGTTGGTGGA GCGATTT-3'，下 游：5'-GGCTGAACGCCACTTG TCC-3'。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min、94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，采用2-△△Ct方法計(jì)算出RAGE表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)量3次。

1.5 各組細(xì)胞增殖檢測(cè)

使用MTT比色法檢測(cè)各組乳腺癌BT474細(xì)胞增殖情況。在細(xì)胞培養(yǎng)后將細(xì)胞濃度調(diào)整至3×104/mL，接種于96孔板中，將200 μL細(xì)胞懸液加入至每孔中，在37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24、48、72 h后，加入10 μL MTT試劑繼續(xù)孵育4 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為570 mm的細(xì)胞組OD值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=（細(xì)胞組OD值/參照組OD值）×100%。

1.6 各組細(xì)胞凋亡檢測(cè)

使用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)各組乳腺癌BT474細(xì)胞凋亡情況。將乳腺癌BT474細(xì)胞使用0.25%胰蛋白酶消化，加入2%BSA試劑防止乳腺癌BT474細(xì)胞消化過(guò)度；使用去離子水稀釋胰蛋白酶液體；對(duì)胰蛋白酶液體表面懸浮細(xì)胞離心5 min進(jìn)行收集，使用PBS洗液洗滌乳腺癌BT474細(xì)胞，在樣本中加入300 μL胰蛋白酶液剩余表層乳腺癌BT474細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC均勻混合搖晃，于避光環(huán)境下室溫保存20 min，取出樣本置于光鏡下觀測(cè)到Annexin V與乳腺癌BT474細(xì)胞發(fā)生結(jié)合后，進(jìn)行乳腺癌BT474細(xì)胞凋亡數(shù)檢測(cè)，讀取數(shù)值并記錄。

1.7 各組細(xì)胞遷移能力檢測(cè)

采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組乳腺癌BT474細(xì)胞遷移能力。將細(xì)胞接種于18孔板中，當(dāng)細(xì)胞增長(zhǎng)至90%左右時(shí)，采用100 μL槍頭垂直劃3條直線，使用PBS反復(fù)洗滌3次，每次洗滌3 min，加入0.5%血清培養(yǎng)基，觀察24 h，使用倒置顯微鏡觀察各組乳腺癌BT474細(xì)胞遷移能力。重復(fù)檢測(cè)3次，取均值。

1.8 各組細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)

采用Transwell小室檢測(cè)各組乳腺癌BT474細(xì)胞侵襲能力。培養(yǎng)板中放置Transwell小室，細(xì)胞懸液接種于上室，并于上室添加matrigel乳腺癌BT474細(xì)胞培養(yǎng)模型，100 ng/mL IL-8接種于下室，24 h后100 μg/mL TMP溶液入至下室，孵育24 h。將上室微孔中的細(xì)胞使用棉簽擦除，PBS反復(fù)洗滌3次（每次洗滌3 min）后，將其固定于4%多聚甲醛溶液中，固定處理15 min，使用蘇木精染色處理10 min，再次使用PBS洗滌，在倒置顯微鏡下觀察上室微孔下層的細(xì)胞數(shù)，觀察各組乳腺癌BT474細(xì)胞侵襲能力。重復(fù)檢測(cè)3次，取均值。

1.9 各組細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)量檢測(cè)

采用免疫印跡檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路蛋 白PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、caspase 3、Bcl-2以及Bax表達(dá)量。提取細(xì)胞蛋白，BCA法定量分析，50 μg蛋白樣品上樣后做SDS-PAGE電泳處理，之后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，避光封閉1 h洗滌，加入1∶1000比例稀釋的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、caspase 3、Bcl-2、Bax一抗，4℃下過(guò)夜，洗滌，加入1∶5000比例稀釋的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、caspase 3、Bcl-2、Bax二抗，溫床孵育1 h后洗滌，發(fā)光液ECL加入，曝光3次，取重疊值。分析蛋白條帶灰度值。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。重復(fù)檢測(cè)3次，取均值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用F值檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多時(shí)間點(diǎn)內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量資料，做重復(fù)測(cè)量方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAGE轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證

與對(duì)照組（4.06±1.03）比較，上調(diào)組RAGE（7.98±2.57）升高及下調(diào)組RAGE（2.74±0.55）降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；上調(diào)組與下調(diào)組RAGE差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明RAGE轉(zhuǎn)染成功。

2.2 各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖率比較

結(jié)果顯示（表1），上調(diào)組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；下調(diào)組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖率均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；下調(diào)組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖率均低于上調(diào)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖率比較（n=5，±s，%）

表1 各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖率比較（n=5，±s，%）

*P＜0.05 vs對(duì)照組；△P＜0.05 vs上調(diào)組

組別 24 h 48 h 72 h對(duì)照組 30.34±3.48 29.68±3.48 30.16±4.12上調(diào)組 55.68±8.25* 62.28±11.14* 75.46±13.58*下調(diào)組 25.36±2.49*△ 20.18±2.17*△ 15.24±1.62*△P 0.001 0.001 0.001

2.3 各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)凋亡率比較

結(jié)果顯示（表2），上調(diào)組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)凋亡率均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；下調(diào)組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)凋亡率均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；下調(diào)組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)凋亡率均高于上調(diào)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)凋亡率比較（n=5， ±s，%）

表2 各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)凋亡率比較（n=5， ±s，%）

*P＜0.05 vs對(duì)照組；△P＜0.05 vs上調(diào)組

組別 24 h 48 h 72 h對(duì)照組 62.34±6.12 63.15±6.58 62.19±5.46上調(diào)組 51.24±6.35* 36.25±3.45* 22.17±3.29*下調(diào)組 75.68±7.68*△ 82.46±8.52*△ 88.69±10.68*△P 0.001 0.001 0.001

2.4 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較

結(jié)果顯示（表3，圖1、2），上調(diào)組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；下調(diào)組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；下調(diào)組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)均低于上調(diào)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組細(xì)胞遷移能力比較

表3 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較（±s，個(gè)）

表3 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較（±s，個(gè)）

*P＜0.05 vs對(duì)照組；△P＜0.05 vs上調(diào)組

組別 細(xì)胞遷移數(shù) 細(xì)胞侵襲數(shù)對(duì)照組 216.35±12.05 238.59±15.49上調(diào)組 388.69±36.17* 421.26±46.38*下調(diào)組 102.35±10.02*△ 99.65±9.57*△P 0.001 0.001

2.5 各組細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較

結(jié)果顯示（圖3，表4），上調(diào)組p-PI3K、PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組，caspase 3、Bax蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；下調(diào)組p-PI3K、PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組，caspase 3、Bax蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；下調(diào)組p-PI3K、PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)量低于上調(diào)組，caspase 3、Bax蛋白表達(dá)量高于上調(diào)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 各組細(xì)胞侵襲能力比較，結(jié)晶紫染色，×40

表4 各組細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較（±s）

表4 各組細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較（±s）

*P＜0.05 vs對(duì)照組；△P＜0.05 vs上調(diào)組

組別 PI3K p-PI3K Akt p-Akt Caspase 3 Bcl-2 Bax對(duì)照組 1.05±0.19 1.22±0.14 1.12±0.21 1.00±0.13 1.08±0.19 1.03±0.15 1.06±0.19上調(diào)組 1.52±0.16* 1.68±0.29* 1.36±0.32* 1.42±0.26* 0.53±0.12* 1.44±0.28* 0.65±0.11*下調(diào)組 0.72±0.10*△ 0.65±0.16*△ 0.23±0.05*△ 0.12±0.02*△ 1.55±0.21*△ 0.52±0.09*△ 1.49±0.21*△P 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

圖3 各組細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白免疫印跡圖

3 討論

目前研究表明，乳腺癌多數(shù)患者預(yù)后不良，其原因與乳腺癌細(xì)胞過(guò)度增殖、遷移相關(guān)[4]。目前臨床對(duì)于乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲的機(jī)制尚不明確，因此尋找能夠抑制腫瘤增殖、侵襲的分子靶點(diǎn)對(duì)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移尤為重要。

RAGE是一種于1992年被Neeper首次從牛肺組織中分離出的一種晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）受體，屬于一種跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，定位在染色體6p21.3上，大約由404個(gè)氨基酸所組成[5]。臨床研究表明，RAGE由胞內(nèi)區(qū)、胞外區(qū)、單次跨膜區(qū)所構(gòu)成，其中胞內(nèi)區(qū)包括N端的2個(gè)恒定區(qū)和3個(gè)免疫球樣區(qū)[6]。有研究表明[7-8]，RAGE為免疫超家族的成員，屬于多配體受體，研究顯示[9]，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，RAGE能與細(xì)胞外的S100A4結(jié)合，通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（MAPK/ERK）和低氧信號(hào)傳導(dǎo)通路，促使腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[10]。目前關(guān)于RAGE與乳腺癌的關(guān)系及參與此病的機(jī)制研究較少，鄭立紅等[11]在其研究中證實(shí)RAGE在乳腺癌組織中高表達(dá)，且與患者疾病特征相關(guān)。Kwak 等[12]研究顯示靶向RAGE配體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可影響乳腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力。故本研究分析RAGE與乳腺癌的關(guān)系，為其在乳腺癌中的表達(dá)提供參考。

研究表明[13-14]，當(dāng)AGE與RAGE相結(jié)合后可激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)其通路蛋白異常表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞異常增殖。PI3K/Akt信號(hào)通路是極為重要的信號(hào)通路，與惡性腫瘤、炎癥反應(yīng)過(guò)程相關(guān)，在肺癌、胃癌、乳腺癌等癌細(xì)胞中處于激活狀態(tài)[15-16]。Akt屬于PI3K/Akt信號(hào)通路的中心蛋白，此通路被激活后促使PI3K表達(dá)升高，促進(jìn)Akt磷酸化，進(jìn)而對(duì)下游分子進(jìn)行調(diào)控，最終參與癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等[17-18]。Lan等[19]報(bào)道，RAGE/PI3K/AKT/mTOR軸變化與人胰腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)。另外，Zhang 等[20]研究證實(shí)RAGE可經(jīng)依賴于PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移。但目前并未有研究認(rèn)為，RAGE經(jīng)PI3K/Akt信號(hào)通路參與乳腺癌細(xì)胞惡變。Bax、Bcl-2、caspase 3與細(xì)胞凋亡、遷移相關(guān)，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Bcl-2家族中Bax等促凋亡蛋白會(huì)加工并修飾蛋白質(zhì)，使其移位至線粒體外膜上，進(jìn)而釋放caspase、細(xì)胞色素C等促凋亡相關(guān)因子，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡[21-22]。研究結(jié)果顯示，下調(diào)RAGE經(jīng)作用于PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)乳腺癌BT474細(xì)胞凋亡，抑制其增殖、遷移、侵襲作用。

綜上所述，下調(diào)RAGE經(jīng)作用于PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制p-PI3K、PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)caspase 3、Bax表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。