不同年份干紅葡萄酒單寧結(jié)構(gòu)特性與澀感強(qiáng)度的關(guān)系

李雨宇，楊佳薈，袁春龍，2*

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院 陜西楊凌 712100 2 西北農(nóng)林科技大學(xué)寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗示范站 寧夏永寧 750104）

葡萄酒中的單寧是一類由非?；钴S的基本分子通過縮合或聚合作用形成的酚類化合物[1]。根據(jù)單寧化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，可將其分為2 類：一類是來自于葡萄漿果中的縮合單寧；另一類是來自于橡木桶中的水解單寧。其中，縮合單寧又稱原花青素，是由黃烷-3-醇單體通過C-C 鍵縮合而成的低聚物或多聚物。這些單體在葡萄皮和葡萄籽中的存在略有不同，籽中的縮合單寧主要由（+）-兒茶素 （Catechin，C）、（-）-表兒茶素（Epicatechin，EC）和（-）-表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）組成[2]，而果皮中的縮合單寧主要有（+）-棓酸兒茶素 （Gallocatechin，GC）、（-）-表棓兒茶素（Epigallocatechin，EGC）和（-）-表棓兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）[3]。

不同的結(jié)構(gòu)單元對葡萄酒的澀感影響存在差異，如表兒茶素的澀感較兒茶素強(qiáng)，在口腔中持續(xù)的時間更久[4]。Scharbert 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，與其它黃烷-3-醇單體相比，人們似乎對表棓兒茶素沒食子酸酯的感官閾值較低。研究表明，沒食子?；拇嬖跁黾泳频臐校谘由靵喕^高比例的表兒茶素和末端亞基中較高比例的棓酸兒茶素均會增加酒的澀感，且延伸亞基和末端亞基中的表棓兒茶素含量與澀感負(fù)相關(guān)[6]。除單寧的結(jié)構(gòu)組成及其立體化學(xué)會影響葡萄酒的澀感外，單寧的聚合度也是影響澀感的關(guān)鍵因素，單寧的澀感強(qiáng)度隨著聚合度的增加而顯著增加，并且單寧的聚合度越高，疏水基團(tuán)越多，單寧和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合親和力越高，澀感就越強(qiáng)[7]。此外，葡萄酒中的澀感強(qiáng)度與單寧含量間也呈顯著正相關(guān)[8]。

目前，對單寧結(jié)構(gòu)的測定，通常是以其分離純化后產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)單元組成、末端單元和延伸單元組成、連接方式及平均聚合度等的研究為主，常用的分析方法有色譜技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)、核磁共振技術(shù)及各種分析方法的聯(lián)用等。其中，色譜技術(shù)因操作簡便、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確等優(yōu)點，而廣泛用于植物單寧的結(jié)構(gòu)分析中，如凝膠滲透色譜常用于單寧分子質(zhì)量的測定[9]，而高效液相色譜可用于單寧純度[10]、聚合度[11]、含量[9]等的檢測，以及與質(zhì)譜聯(lián)用以分析單寧的結(jié)構(gòu)類型[12]。李輝等[13]利用超高效液相色譜-電噴霧多級質(zhì)譜（UHPLC-ESI-MS）測定葡萄酒中游離態(tài)C、EC、EGC 單體及二聚體、三聚體含量，通過對酒樣的感官評價，建立酚類物質(zhì)與澀感間的相關(guān)關(guān)系。Chira 等[14]利用高效液相色譜測定不同年份赤霞珠葡萄酒的單寧含量、平均聚合度、原翠雀素占比、沒食子?；潭燃皾袕?qiáng)度，揭示其隨陳釀時間延長的變化規(guī)律。然而，對于不同陳釀年份葡萄酒中單寧含量及其游離態(tài)和聚合態(tài)結(jié)構(gòu)組分的系統(tǒng)研究較少。

本文以內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)不同年份的赤霞珠和蛇龍珠干紅葡萄酒為材料，對其總單寧含量、游離態(tài)黃烷-3-醇單體含量、縮合單寧結(jié)構(gòu)組分和澀感強(qiáng)度進(jìn)行分析與評價，旨在揭示不同陳釀年份酒樣間單寧含量與結(jié)構(gòu)差異及其與澀感間的關(guān)系，為葡萄酒的陳釀技術(shù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表1 8 種供試干紅葡萄酒的品種、年份及澀感強(qiáng)度Table 1 Grape cultivar，vintage and astringencyintensity of 8 kinds of dry red wines

（+）-兒茶素、（-）-表兒茶素、（-）-表兒茶素沒食子酸酯、（+）-棓酸兒茶素、（-）-表棓兒茶素、（-）-表棓兒茶素沒食子酸酯（純度>98%），上海源葉生物科技有限公司；Toyopearl HW-40C 凝膠樹脂，日本TOSOH 公司；牛血清蛋白（純度>98%），美國Amresco 公司；甲醇、乙腈（色譜純級），美國Tedia 公司；間苯三酚，山東西亞化學(xué)股份有限公司；乙酸鈉，天津博迪化工股份有限公司；福林酚，北京索萊寶科技有限公司；三氟乙酸、乙酸乙酯、丙酮、磷酸（分析純級），四川西隴化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC I-Class 超高效液相色譜儀，美國Waters 公司；Cray-60 紫外-可見分光光度計，美國安

捷倫公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；FD-1C-50 冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；TGL-18M 高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 酒樣常規(guī)理化指標(biāo)的測定

酒樣中的可滴定酸（酒石酸計）、pH 值及酒度的測定參照《葡萄酒分析檢驗》[15]的方法，所有指標(biāo)均重復(fù)測定3 次，下同。

1.4 酚類物質(zhì)的測定

葡萄酒中總酚和花色苷含量的測定均參照蘇鵬飛[16]的方法。

1.5 總單寧含量的測定

總單寧含量的測定采用胡立志等[17]的蛋白-單寧沉淀法。

1.6 游離態(tài)黃烷-3-醇單體含量的測定

取10 mL 酒樣加入等體積乙酸乙酯，漩渦振蕩2 min，3 500 r/min、4 ℃離心3 min，重復(fù)萃取3次收集有機(jī)相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀35 ℃蒸干，用色譜甲醇溶解殘渣，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾后，于-20℃冰箱中保存，待UPLC 分析。

UPLC 色譜條件：采用ACQUITY UPLC BEH HILIC C18 色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）。流動相A 為體積分?jǐn)?shù)為0.2%磷酸的水溶液，流動相B為體積比為4∶1 的乙腈：0.2%磷酸水溶液。梯度洗脫程序：0～6 min，10% B；6～9 min，10%～15% B；9～12 min，15%～20% B；12～13 min，20%～30% B；13～15 min，30%～10% B。流速0.2 mL/min；柱溫：25 ℃；樣品溫：4 ℃；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：0.5 μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。

社交娛樂方面，絕大多數(shù)學(xué)生參加各種社交娛樂的時間和頻次正常。學(xué)生談戀愛現(xiàn)象比較普遍，問卷表明，大三學(xué)生中談戀愛的已占到班級的七成以上。而認(rèn)為談戀愛對自己產(chǎn)生積極影響、負(fù)面影響的，后者略高于前者，約各占三成左右。絕大多數(shù)學(xué)生在與親友QQ、微信或電話聊天，參加朋友聚會、聚餐，逛街、購物，節(jié)假日及假期外出旅游，到歌廳、茶室等公眾娛樂場所玩樂的時間和頻次，均在正常范圍之內(nèi)。

表2 六種黃烷-3-醇單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 2 Regression equations for six kinds of flavan-3-ols monomers

1.7 縮合單寧結(jié)構(gòu)組分的測定

將50 mL 酒樣上樣至Toyopearl HW-40C 凝膠柱（30 mm×250 mm），依次經(jīng)300 mL 0.05%的三氟乙酸溶液、300 mL 甲醇/水 （體積比1 ∶1）和150 mL 丙酮/水（體積比2 ∶1）洗脫，收集丙酮部分，在38 ℃下減壓濃縮以除去丙酮，最后用冷凍干燥機(jī)凍干，于-20 ℃冰箱中保存。

將上述干粉溶于10 mL 色譜甲醇中，取1 mL加入等體積的間苯三酚溶液（含有0.1 mol/L 鹽酸的甲醇溶液，50 g/L 的間苯三酚和10 g/L 的抗壞血酸），將反應(yīng)混合物于50 ℃放置20 min，然后加入5 倍體積的40 mmol/L 乙酸鈉溶液以終止反應(yīng)。所形成的產(chǎn)物經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，經(jīng)UPLC 分析聚合態(tài)縮合單寧的結(jié)構(gòu)組分。色譜條件同上，定性參考Kennedy[18]的方法。

1.8 澀感評價

澀感評價小組由11 名具有葡萄酒品嘗基礎(chǔ)且經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練的成員組成。在評價酒樣前，系統(tǒng)培訓(xùn)了小組成員澀感的相關(guān)知識，并利用不同溶液區(qū)分澀感（3 g/L 單寧）與酸（3 g/L 酒石酸）、甜（15 g/L 蔗糖）、苦味（15 mg/L 硫酸奎寧）之間的差異。之后，對質(zhì)量濃度范圍為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 g/L 的單寧模擬酒溶液進(jìn)行反復(fù)定位。在對酒樣進(jìn)行評價時，采用五點標(biāo)度法對澀感強(qiáng)度進(jìn)行評價，5 分為最強(qiáng)，4 分較強(qiáng)，3 分為中等強(qiáng)度，2 分較弱，1 分為最弱，幾乎感覺不到。每評價完一款酒樣后，用去離子水漱口2 次，并咀嚼蘇打餅干使味覺得到恢復(fù)，且在對下一酒樣進(jìn)行評價前至少等待30 s，每個酒樣的評價在5 min 內(nèi)完成[19]。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2013 和Origin 9進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形繪制，利用IBM SPSS Statistics 20.0 進(jìn)行顯著性分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)理化指標(biāo)和酚類物質(zhì)含量分析

表3給出了葡萄酒樣品的常規(guī)理化指標(biāo)和酚類物質(zhì)含量。其中，赤霞珠葡萄酒的總酸含量在5.73～6.06 g/L 之間，pH 值在3.76～4.07 之間，酒度在11.51%Vol～13.69%Vol 之間；蛇龍珠葡萄酒的總酸在4.89～6.58 g/L 之間，pH 值在3.85～4.17 之間，酒度在10.07%Vol～11.75%Vol 之間。對于酚類物質(zhì)而言，赤霞珠葡萄酒的總酚含量在1 368.65～1 847.84 mg/L 之間，蛇龍珠葡萄酒的總酚含量在1 012.99～1 567.95 mg/L 之間，不同年份間總酚含量存在顯著差異，這可能是不同年份間的氣候條件差異所導(dǎo)致的。此外，赤霞珠葡萄酒的花色苷含量在35.39～250.77 mg/L 之間，蛇龍珠的花色苷含量在31.41～223.53 mg/L 之間，且其含量隨著陳釀時間的延長，呈顯著降低的趨勢，這與Chira 等[20]研究結(jié)果相同。

表3 常規(guī)理化指標(biāo)和酚類物質(zhì)含量Table 3 Phyto-chemical indicators and polyphenols contents

2.2 總單寧含量分析

由圖1可知，不同葡萄酒樣品的總單寧含量在20.28～75.50 mg/L 之間，蛇龍珠葡萄酒的總單寧含量明顯低于赤霞珠葡萄酒，說明葡萄酒中總單寧含量受葡萄品種的影響。大體而言，新酒中的總單寧含量顯著高于陳釀酒，這與前人的研究結(jié)果一致[13-14]。陳釀酒中較低的單寧和花色苷含量主要是由于葡萄酒在陳釀過程中，兩者之間相互結(jié)合，不僅形成橘黃色的產(chǎn)物，也使得兩者的含量逐漸降低[21]。

圖1 不同葡萄酒樣品的總單寧含量Fig.1 Total tannin content of different wines

2.3 游離態(tài)黃烷-3-醇單體含量分析

溫鵬飛等[22]采用HPLC 法同時測定了葡萄酒中C、EC、ECG、EGC 和EGCG 5 種單體含量，其中，在干紅葡萄酒中，C（33.81～51.04 mg/L）和EC（37.60～50.89 mg/L）含量相對較高，EGC（3.68～5.87 mg/L）和EGCG（1.45～6.22 mg/L）次之，ECG（0～2.39 mg/L）含量最低。Quijadamorín 等[6]采用HPLC-DAD/ESI/MS 測定了不同產(chǎn)區(qū)和年份的丹魄葡萄酒中C、EC、ECG、EGC 和GC 5 種黃烷-3-醇單體的含量，其中，在不同酒樣中，C 含量最高（占37%～51%），GC（22%～34%）和EC（16%～28%）次之，EGC（4%～9%）和ECG（<1%）含量相對較低。而本研究在此基礎(chǔ)上，利用UPLC 同時測定了葡萄酒中C、EC、GC、ECG、EGC 和EGCG 6 種黃烷-3-醇單體的含量，具有簡單、高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點。

由圖2可知，在不同酒樣中，C 含量占比（30.75%～53.69%）最高，EC（24.55%～38.93%）和EGC（5.15%～25.71%）次之，GC（4.16%～13.90%）、EGCG（2.92%～11.04%）和ECG（0.33%～1.90%）含量較少，與溫鵬飛等[22]研究結(jié)果一致，而與Quijadamorín 等[6]的研究結(jié)果存在差異，文獻(xiàn)報道GC含量在C、EC、ECG、EGC、GC 5 種黃烷-3-醇單體中占比22%～34%，而本研究中GC 含量相對較低，這可能是由品種和產(chǎn)地差異造成的。此外，新酒中的黃烷-3-醇單體含量大體上高于陳釀酒。對比不同單體，新酒中的C 和ECG 含量較高，陳釀酒中的EGC 和GC 含量較高，而EC 和EGCG 在新酒和陳釀酒中的含量差異不大。

圖2 不同葡萄酒樣品游離態(tài)黃烷-3-醇單體的含量Fig.2 Flavan-3-ols monomers content of different wines

2.4 聚合態(tài)縮合單寧結(jié)構(gòu)組分分析

表4顯示，在各酒樣的末端單元中，C 含量占比最高（16.80%～27.34%），EC 次之（9.66%～22.44%），ECG 占比最低（0.58%～2.68%）；而在延伸單元中，EC 含量占比最高（37.66%～54.88%），EGC（4.45%～9.11%）和ECG（1.70%～10.85%） 占比次之，C 含量占比最低（0.85%～1.99%），這與Hanlin 等[23]和Gonzalo-Diago 等[24]的研究結(jié)果一致。蛇龍珠葡萄酒末端單元中C 和EC 的占比均高于赤霞珠葡萄酒，而延伸單元中EC 和ECG 占比卻低于赤霞珠葡萄酒，表明縮合單寧的結(jié)構(gòu)組成在不同品種間存在差異。

度合聚其及分組構(gòu)結(jié)的寧單合縮品樣酒萄葡同不4表，main structural characteristics and mDP of condensed tannin from different wines Compositon Table 4 /%元單伸延/%元單端末mDP %G %PD %PC樣酒ECG EC C EGC ECG EC C珠霞赤b 3.16±0.03 c 0.75±0.06 a c 21.87±0.22 77.38±0.28 c 4.62±0.40 b 49.68±0.71 a 1.20±0.08 b 8.59±0.08 c 0.80±0.14 a a 15.38±0.01 19.74±0.27 2011 b 3.22±0.07 c 0.74±0.07 a c 22.61±0.19 76.65±0.12 c 4.58±0.37 b ab 49.92±0.53 1.04±0.07 a 8.92±0.11 c 0.90±0.05 a a 15.44±0.38 19.22±1.20 2012 a 3.49±0.04 a 2.36±0.07 b b 18.50±0.31 a 79.13±0.24 b 10.85±0.28 50.95±0.40 b 1.00±0.08 c 6.73±0.14 b 1.46±0.01 c 9.66±0.04 a 19.38±0.13 2017 a 3.48±0.00 b 1.93±0.05 c a 14.58±0.29 83.49±0.24 b 8.27±0.16 a 54.88±0.11 b 0.85±0.00 d 5.26±0.12 a 1.99±0.00 b b 11.97±0.17 16.80±0.03 2018珠龍蛇a 2.95±0.01 a 0.03±0.01 a c 22.77±0.35 77.20±0.34 b 1.70±0.02 a 48.60±0.22 b 1.07±0.14 a 9.11±0.16 c 0.83±0.01 d c 16.05±0.02 22.64±0.05 2010 c 2.37±0.01 a 0.07±0.01 a c 22.28±0.47 77.65±0.46 a 3.30±0.02 d 37.66±0.48 a 1.99±0.09 b 8.43±0.22 a 2.68±0.31 b a 18.77±0.03 27.18±0.49 2011 b 2.48±0.01 a 0.11±0.08 b b 16.03±0.84 83.86±0.77 b 1.97±0.30 b 46.30±0.40 b 1.24±0.10 c 6.19±0.36 c 0.58±0.00 c b 17.84±0.00 25.90±0.25 2017 d 2.05±0.02 a 0.08±0.03 c a 11.97±0.18 87.94±0.15 a 3.20±0.16 c 39.29±0.30 a 1.95±0.03 d 4.45±0.07 b 1.33±0.09 a a 22.44±0.34 27.34±0.06 2018，%度程化酰子食：沒；%G量的質(zhì)物總量/的質(zhì)物EGC元單伸延及元單端末，%PD=比占素雀翠：原；%PD量的質(zhì)物總量/的質(zhì)物、EC C元單伸延及、EC C元單端末，%PC=比占素青花：原：%PC注。量的質(zhì)物總元單端末量/的質(zhì)物總，mDP=度合聚均：平；mDP量的質(zhì)物總/量的質(zhì)物G=ECG

就縮合單寧的結(jié)構(gòu)特性而言，在不同酒樣中，原花青素占比（%PC）最高，原翠雀素占比（%PD）次之，沒食子?；潭日急龋?G）最低，與Gonzalo-Diago 等[24]的研究結(jié)果一致。隨著陳釀時間的延長，%PC 呈降低的趨勢，而%PD 則呈升高的趨勢。此外，2011年和2012年的赤霞珠葡萄酒間及2010年和2011年的蛇龍珠葡萄酒間，%PC、%PD 和%G 差異不顯著，說明陳釀8～9年的干紅葡萄酒，其單寧的結(jié)構(gòu)逐漸趨于穩(wěn)定。在所研究酒樣中，其平均聚合度在2.05～3.49 之間，表明二聚體和三聚體可能是縮合單寧聚合物的主要存在形式，與Quijadamorín等[6]研究結(jié)果相近（2.9～4.3），而略低于Gonzalo-Diago 等[24]關(guān)于丹魄葡萄酒平均聚合度的研究結(jié)果（4.62～6.38），這可能與所研究的葡萄酒的產(chǎn)地及品種有關(guān)。

2.5 澀感強(qiáng)度與葡萄酒組分間的關(guān)系分析

將葡萄酒中的各組分與澀感強(qiáng)度進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖3。澀感強(qiáng)度位于第1 主成分的正方向，與總單寧、平均聚合度、延伸單元EC、ECG、單體EGCG 及%G 關(guān)聯(lián)度較強(qiáng)，說明澀感強(qiáng)度受這些因素的影響較大。其中，與Gawel 等[25]和Gonzalo-Diago 等[24]的研究結(jié)果相同，總單寧含量升高，葡萄酒的澀感強(qiáng)度也會增強(qiáng)，這是因為干燥等澀味感受通常是由單寧與唾液蛋白相互作用引起的。此外，澀感強(qiáng)度與平均聚合度（mDP）間也呈正相關(guān)關(guān)系，其強(qiáng)度隨酒樣平均聚合度的升高而增強(qiáng)，這與Chira 等[7]和Mcrae 等[26]研究結(jié)果一致。在各結(jié)構(gòu)組分中，延伸單元中較高含量的EC、ECG 及游離態(tài)單體EGCG 會使?jié)袕?qiáng)度增加，而末端單元C、EC 和延伸單元C 則與澀感強(qiáng)度負(fù)相關(guān)，酒樣中較高比例的此類組分，則會使?jié)袕?qiáng)度降低。第2主成分代表了pH 值、%PC 和花色苷等信息，而%PD、延伸單元EGC 與其負(fù)相關(guān)，澀感強(qiáng)度受這些因素的影響相對較少。

同時，由圖3也可知，研究的8 款酒樣兩兩聚為一類，其中，赤霞珠葡萄酒位于第1 主成分的正半軸，說明其澀感強(qiáng)度較大，且新酒和陳釀酒分別位于第2 主成分的正負(fù)半軸。而蛇龍珠葡萄酒位于第1 主成分的負(fù)半軸，說明其澀感強(qiáng)度相對較低，且新酒與陳釀酒的分布同赤霞珠葡萄酒相同，分別位于第2 主成分的正負(fù)半軸，說明利用這些指標(biāo)可以對葡萄酒的品種及陳釀年份進(jìn)行一定的劃分。

圖3 前兩個主成分上的葡萄酒組分、澀感強(qiáng)度與酒樣分布Fig.3 Loadings of wine components，astringency intensity and wine sample distribution in the first two PCs

3 結(jié)論

對內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)不同年份赤霞珠和蛇龍珠葡萄酒單寧測定的結(jié)果表明，總單寧含量會受葡萄品種的影響，且新酒中的含量顯著高于陳釀酒。兒茶素和表兒茶素是葡萄酒中最主要的兩種游離態(tài)黃烷-3-醇單體，且新酒中的黃烷-3-醇單體含量高于陳釀酒，對于不同單體，新酒中的兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯含量較高，陳釀酒中的表棓兒茶素和棓酸兒茶素含量較高，而表兒茶素和表棓兒茶素沒食子酸酯在新酒和陳釀酒中的含量差異不大。此外，所研究酒樣的聚合態(tài)縮合單寧主要以二聚體和三聚體的形式存在，兒茶素和表兒茶素分別是末端單元和延伸單元中含量最豐富的單體，在其結(jié)構(gòu)特性中，原花青素占比（%PC）最高，原翠雀素占比（%PD）次之，沒食子酰化程度占比（%G）最低，且新酒中的%PC 占比較高，而陳釀酒中的%PD 占比較高，陳釀8～9年的干紅葡萄酒，單寧的結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。

葡萄酒中各組分和澀感強(qiáng)度間的主成分分析表明，葡萄酒的澀感會隨總單寧含量的升高或平均聚合度的增大而強(qiáng)度增大。同時，其受游離態(tài)單體表棓兒茶素沒食子酸酯、延伸單元表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯的影響也較大，而末端單元中較高含量的兒茶素和表兒茶素及延伸單元較高含量的兒茶素，則會使?jié)袕?qiáng)度降低。此外，葡萄酒的總酸、pH 值、酒度、總酚、花色苷及游離態(tài)單體對澀感的影響相對較小。