竹茹經(jīng)Gas6/Axl通路對食管癌ECA109、TE1細(xì)胞的影響研究

康樹宏 呂峰 韓繼明

竹茹具有滌痰開郁、清熱止嘔的功效，在多種方劑中可見?，F(xiàn)代藥理證實，竹茹中含有多種有效成分，如丁香醛、苜蓿素等，進而發(fā)揮藥效，起到治療疾病的目的[1]。食管癌屬于常見消化道惡性腫瘤，多數(shù)患者術(shù)后可以獲得良好預(yù)后，但是仍有少數(shù)患者會出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移情況[2]。有報道指出，Gas6/Ax1信號通路在食管癌進展中起關(guān)鍵性作用，認(rèn)為調(diào)控Gas6/Axl通路可對食管癌細(xì)胞遷移、侵襲產(chǎn)生抑制[3]。目前臨床關(guān)于竹茹抗癌治療的研究筆者所見并不多，僅有少量學(xué)者認(rèn)為竹茹不僅具有抑菌作用，對癌細(xì)胞增殖同樣可以起到抑制作用[4]。本研究通過制取竹茹提取液對食管癌細(xì)胞進行干預(yù)，分析竹茹對食管癌細(xì)胞遷移、侵襲能力及Gas6/Axl通路相關(guān)蛋白的影響，進一步證實竹茹是否存在抗癌價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 組織樣本:選取第四軍醫(yī)大學(xué)2019年1月至2020年12月接受食管癌切除手術(shù)患者術(shù)后組織樣本，分別獲取20例患者食管癌組織及癌旁組織。

1.1.2 細(xì)胞株:人源鱗狀食管癌細(xì)胞株ECA109和TE1，由武漢尚恩生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.3 藥物制備:竹茹購于北京同仁堂有限公司，并經(jīng)專家鑒定。首先對竹茹進行稱重，粉碎后加入適量水浸泡，煎煮成藥液，過濾后懸蒸，待藥液粘稠后進行冷凍處理，制成竹茹凍干粉，之后制備100 μg/ml、200 μg/ml含竹茹培養(yǎng)基，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 實驗試劑:PBS緩沖劑、蛋白酶抑制劑(BI，以色列)，羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、Ax1抗兔一抗(Rockland，美國)，Gas6一抗(Sigma，美國)，胰蛋白酶、培養(yǎng)基(Gibco，美國)，PVDF膜(Millipore，美國)，胎牛血清(BI，以色列)等。

1.1.5 實驗儀器:顯微鏡(尼康，日本)，勻漿機(新芝公司)，水浴箱(上海赫田科學(xué)儀器有限公司)，電化學(xué)發(fā)光儀(羅氏，瑞士)，生化檢測分析儀(日立，日本)，離心機(華東公司)，電泳儀(Bio-Rad，美國)，數(shù)字天平、切片機等。

1.2 方法

1.2.1 HE染色:取未經(jīng)放化療干預(yù)的食管癌組織及癌旁組織，其中癌旁組織作為對照組，食管癌組織根據(jù)干預(yù)藥物濃度不同分為竹茹低劑量組(100 μg/ml)、竹茹高劑量組(200 μg/ml)，經(jīng)脫蠟、水化處理，蘇木素染色2 min，沖洗載玻片，直至無染色劑脫落，進行5 min此同時鹽酸酒精分化，沖洗后加熱處理，采用伊紅復(fù)染，沖洗，經(jīng)梯度脫水后封片，顯微鏡下對組織染色情況進行觀察。

1.2.2 組織樣本Gas6免疫組化分析:取組織樣本，經(jīng)脫水、透明處理后進行石蠟包埋，切成4 μm厚度組織切片，65℃烤箱烘烤50 min，經(jīng)脫蠟、水化處理，PBS漂洗，滴加抗原修復(fù)液，加熱變性，PBS沖洗，滴加去離子水進行避光反應(yīng)，10 min后沖洗，滴加抗體，滴加PBS作為陰性對照，孵育2 h，37℃，PBS沖洗，滴加二抗，室溫，30 min，滴加DAB進行顯色，染色采用蘇木素，蒸餾水沖洗后封片，顯微鏡觀察組織染色情況，將染為棕褐色細(xì)胞判定為陽性。

1.2.3 組織樣本Ax1免疫熒光實驗:取食管癌及癌旁組織樣本，制成石蠟切片，加入抗原修復(fù)液，沖洗后甩干，滴加熒光淬滅劑，反應(yīng)結(jié)束后沖洗，滴加BSA孵育30 min，依次添加一抗、二抗，反應(yīng)結(jié)束后加DAPI進行細(xì)胞核復(fù)染，10 min，注意避光，沖洗后封片，鏡下觀察。在紫外的激發(fā)下，細(xì)胞染色后顯示藍色，熒光素標(biāo)記顯示紅光即為NMDAR2B陽性。采用相關(guān)軟件判定染色結(jié)果，獲得樣本陽性累積光密度值(IOD)。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng):取人鱗狀食管癌細(xì)胞株ECA109和TE1，將細(xì)胞株置于水浴箱中進行解凍，輕輕晃動凍存管，促進細(xì)胞溶解。觀察細(xì)胞解凍情況，待完全解凍后加培養(yǎng)基進行離心處理，分離獲得沉淀，加新的培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況，取貼壁后對數(shù)期細(xì)胞進行傳代。細(xì)胞傳代最好控制在50代以內(nèi)，可加入凍存液進行細(xì)胞凍存，用于后續(xù)研究。

1.2.5 配置竹茹培養(yǎng)基:取竹茹凍干粉，加入滅菌后培養(yǎng)基，根據(jù)需求分別配置成為200 μg/ml、100 μg/ml濃度的竹茹培養(yǎng)基，隨配隨用。

1.2.6 免疫雙標(biāo)實驗檢測Gas6、Ax1:取融合度達到90%的ECA109、TE1細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)基，加入胰酶消化，每孔設(shè)置密度為5×104，二氧化碳濃度5%，37℃過夜，鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，分別采用不同濃度竹茹培養(yǎng)基進行干預(yù)，24 h后沖洗，經(jīng)透膜干預(yù)后，再次PBS沖洗，每孔加入稀釋后的一抗，4℃環(huán)境下過夜，棄上清后滴加熒光標(biāo)記的二抗，避光孵育1 h，磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加含DAPI的封片油進行封片，鏡下觀察熒光情況。

1.2.7 EMT標(biāo)志蛋白Snail、N-cadherin(N-ca)、E-cadherin(E-ca)蛋白免疫熒光觀察:取融合度達到90%的ECA109、TE1細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)基，固定采用多聚甲醛進行，結(jié)束后PBS沖洗，同樣進行透膜處理，沖洗后滴加封閉液，滴加稀釋后的一抗，1 h避光孵育，滴加經(jīng)熒光標(biāo)記的二抗，1 h 避光孵育，沖洗后封片，顯微鏡下對細(xì)胞熒光反應(yīng)強度進行觀察。

1.2.8 Westren blotting檢測Ax1、Gas6蛋白表達水平:取食管癌細(xì)胞，將其接種于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞貼壁后進行竹茹干預(yù)，分別采用100 μg/ml、200 μg/ml含竹茹培養(yǎng)基進行干預(yù)，24 h后刮取細(xì)胞，離心處理分離沉淀，滴加常規(guī)培養(yǎng)基進行重懸。采用蛋白提取試劑盒進行總蛋白提取，通過BCA法對提取的蛋白濃度及純度進行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀取562 nm 波長處的OD值，根據(jù)所得數(shù)據(jù)計算上樣DNA蛋白濃度。根據(jù)檢測結(jié)果進行蛋白濃度調(diào)節(jié)，加熱臺上加熱至變性，進行凝膠電泳處理，配膠，上樣待測樣本，在電泳槽中倒入電泳液，高度達到電泳槽2/3處，將電泳儀調(diào)節(jié)至恒壓模式，結(jié)束后進行轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜取出，確定目的蛋白所在區(qū)域，并進行剪裁，保留目的蛋白位置，將其置于轉(zhuǎn)模液中進行轉(zhuǎn)模，結(jié)束后置于封閉液進行封閉，1 h后TPBS洗膜，滴加提前稀釋好的一抗，反應(yīng)結(jié)束后TBPS洗膜后加入顯影液進行顯影，浸潤1 min，以β-ACT作為內(nèi)參，采用JP-K900化學(xué)發(fā)光成像分析儀對顯影情況進行分析，記錄所得圖像。

1.2.9 劃痕實驗:取食管癌細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后進行實驗。劃痕器劃痕，培養(yǎng)基清洗，加入不同濃度竹茹刺激細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，記錄時間分別為0 h、12 h。

1.2.10 Transwell侵襲實驗:取培養(yǎng)基和融化后的Matrigel膠進行充分混合，并且將混合后的液體作為上室液，37℃培養(yǎng)3 h，待聚合呈凝膠后進行后續(xù)實驗，上室加無血清培養(yǎng)基，下室加含20%胎牛血清培養(yǎng)基，在實驗前各組細(xì)胞均饑餓培養(yǎng)12 h，每個上室中加重懸后細(xì)胞進行孵育，分別采用不同濃度竹茹干預(yù)，孵育結(jié)束后，多聚甲醛固定各小室細(xì)胞，擦去上室內(nèi)細(xì)胞及基質(zhì)膠，將下室面完全浸沒在結(jié)晶紫溶液中染色，使用PBS緩沖液沖洗殘留染色液，自然晾干后隨機選取視野進行觀察，時間選擇0、24 h，視野數(shù)量選擇5個，對染色情況進行高倍鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況判斷細(xì)胞侵襲能力。

2 結(jié)果

2.1 食管癌、癌旁組織Gas6、Ax1表達情況 癌旁組織無浸潤食管癌組織Gas6、Ax1高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 食管癌、癌旁組織Gas6、Ax1表達情況比較

圖1 食管癌、癌旁組織Gas6、Ax1表達情況(NC為癌旁組織，ESCC為食管癌組織)；A 免疫熒光檢測Ax1表達；B 免疫組化檢測Gas6表達

2.2 竹茹對Gas6/Ax1信號通路及復(fù)合體的影響 對照組食管癌ECA109、TE1細(xì)胞膜上Gas6、Ax1以及Gas6/Ax1復(fù)合體均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，而竹茹干預(yù)組Gas6、Ax1表達降低，Gas6/Ax1復(fù)合體分離，竹茹高劑量組差異更加明顯。見圖2。

圖2 竹茹對Gas6/Ax1信號通路及復(fù)合體的影響

2.3 竹茹對Gas6、Ax1蛋白表達的影響 在ECA109細(xì)胞中竹茹高劑量組、低劑量組Gas6、Ax1蛋白表達明顯低于對照組(P<0.05)，TE1細(xì)胞中竹茹高劑量組、低劑量組Gas6蛋白表達明顯低于對照組(P<0.05)，竹茹高劑量組Ax1蛋白表達明顯低于對照組(P<0.05)。見表2，圖3。

表2 ECA109及TE1細(xì)胞中Gas6、Ax1蛋白相對表達水平

圖3 ECA109及TE1細(xì)胞中Gas6、Ax1蛋白條帶表達

2.4 竹茹對EMT標(biāo)志性蛋白的影響 在ECA109細(xì)胞中竹茹高劑量組、低劑量組N-ca、Snail蛋白表達明顯低于對照組(P<0.05)，竹茹高劑量組E-ca蛋白表達高于對照組(P<0.05)；在TE1細(xì)胞中竹茹高劑量組、低劑量組Snail蛋白表達明顯低于對照組(P<0.05)，竹茹高劑量組N-ca蛋白低于對照組(P<0.05)，E-ca蛋白高于對照組(P<0.05)。見圖4，表3。

圖4 ECA109及TE1細(xì)胞中EMT標(biāo)志性蛋白條帶表達

表3 ECA109及TE1細(xì)胞中E-ca、N-ca、Snail蛋白相對表達水平

3 討論

食管癌是目前世界上比較高發(fā)的消化道惡性腫瘤，因食管癌發(fā)病初期比較隱匿，導(dǎo)致多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已進展至中晚期，降低治療效果[5]。中醫(yī)學(xué)中食管癌屬于“噎膈病”范疇，通過查閱大量醫(yī)學(xué)文獻我們總結(jié)出“胃脘干耗”是導(dǎo)致食管癌發(fā)病的核心，因此在食管癌治療中“甘潤濡養(yǎng)”是關(guān)鍵[6]。已有研究證實，竹茹可有效改善惡心嘔吐、便秘、吞咽困難等癥狀，并且可緩解患者放化療治療期間所產(chǎn)生的毒副作用[7]。也有報道指出，竹茹對食管癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移抑制作用[8]。因此本研究選取食管癌細(xì)胞進行竹茹干預(yù)，分析其對食管癌細(xì)胞相關(guān)蛋白以及侵襲、遷移能力的影響。

有報道指出，Gas6/Axl信號通路在食管癌的轉(zhuǎn)移、侵襲過程中起到關(guān)鍵性作用[9]。也有學(xué)者選取食管癌組織樣本進行免疫組化分析，結(jié)果證實Gas6、Ax1在肺癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)[10]。Gas6/Axl通路可能參與食管癌的進展和生存預(yù)后，并且在研究中指出Gas6可作為識別高危食管癌的標(biāo)志物[11]。也要學(xué)者認(rèn)為，癌細(xì)胞運動能力及侵襲能力會因Ax1高表達而增強[12]。本研究對食管癌患者食管癌組織及癌旁組織Gas6、Axl蛋白表達情況進行分析，進一步證實Gas6/Axl通路參與食管癌的發(fā)病。本研究結(jié)果顯示竹茹可有效抑制Axl、Gas6蛋白表達，進一步分析可發(fā)現(xiàn)竹茹可對Gas6、Ax1以及Gas6/Ax1復(fù)合體表達產(chǎn)生抑制作用。提示竹茹可有效抑制Gas6、Ax1表達，阻止其發(fā)生進一步綁定和結(jié)合。

惡性腫瘤之所以會發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移主要是因為癌細(xì)胞通過血液、體液等方式遷移、侵襲至其他器官、組織，并進行定植[13]。因此降低腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力對于改善惡性腫瘤患者預(yù)后非常重要[14]。曾有學(xué)者在研究中指出，細(xì)胞侵襲、遷移能力與食管癌遠期預(yù)后之間存在密切聯(lián)系[15]。本研究結(jié)果顯示，竹茹可有效抑制食管癌細(xì)胞侵襲、遷移能力，且存在一定的劑量依賴性。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是一種反應(yīng)程序，可使細(xì)胞喪失極性，降低細(xì)胞間連接強度，致使細(xì)胞發(fā)生游走[16]。

E-ca的表達下調(diào)或缺失可使EMT程序激活，減弱細(xì)胞間粘附性，進而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[17]。N-ca同樣屬于EMT反應(yīng)程序的標(biāo)志物，在食管癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，有報道指出，N-ca與食管癌細(xì)胞的侵襲、惡化存在密切聯(lián)系[18]。Snail同樣屬于EMT程序調(diào)控因子，可對細(xì)胞遷移功能起到抑制作用[19]。曾有學(xué)者在研究中指出，竹茹可有效抑制裸鼠食管癌肺轉(zhuǎn)移，并且在研究中提出，抑制EMT程序相關(guān)蛋白表達是竹茹抑制食管癌肺轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵途徑[20]。本研究對EMT程序相關(guān)蛋白表達水平進行分析，得出竹茹干預(yù)可有效降低食管癌細(xì)胞N-ca、Snail蛋白表達，提高E-ca蛋白表達，提示竹茹可通過調(diào)節(jié)N-ca、Snail、E-ca蛋白表達的方式影響EMT程序進而起到干預(yù)細(xì)胞遷移、侵襲的作用。

綜上所述，Gas6、Ax1在食管癌中呈現(xiàn)高表達，而竹茹干預(yù)可使食管癌細(xì)胞Gas6、Ax1表達降低，抑制其侵襲、遷移能力，并且可能是通過調(diào)控EMT相關(guān)蛋白表達方式實現(xiàn)的。