尿毒癥毒素對血管平滑肌細(xì)胞鈣化影響的基礎(chǔ)研究

段書眾， 馬思佳， 于文會， 張 巖， 賈蘭芳， 董巧榮

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科， 河北 承德 067000)

血管鈣化是慢性腎衰竭患者心腦血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。高磷血癥及高甲狀旁腺素血癥是慢性腎臟病患者普遍存在的代謝紊亂，是此類患者發(fā)生骨質(zhì)疏松和血管鈣化的關(guān)鍵因素[1]。腎小球?yàn)V過率下降和活性維生素D及成纖維細(xì)胞生長因子23水平的變化導(dǎo)致了鈣磷代謝紊亂，細(xì)胞培養(yǎng)、動物模型以及臨床研究均證實(shí)：鈣磷代謝異常在血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。目前公認(rèn)高磷血癥是導(dǎo)致血管鈣化發(fā)生的促進(jìn)因素，可能涉及高磷血癥導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡以及升高血成纖維細(xì)胞生長因子23水平及降低Klotho表達(dá)[2]。但高甲狀旁腺素在能否直接導(dǎo)致血管鈣化方面仍存在爭議[3]。該研究旨在評估高磷血癥與高甲狀旁腺素血癥兩個(gè)因素，哪個(gè)是血管平滑肌細(xì)胞鈣化發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組：在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，體外培養(yǎng)人胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)。每2d更換一次培養(yǎng)液，采用0.25%胰酶作為消化液進(jìn)行細(xì)胞傳代，應(yīng)用第5～8代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。設(shè)置對照組、高磷組(β-甘油磷酸鈉調(diào)整培養(yǎng)基內(nèi)磷濃度為2.6mmoL/L，依據(jù)第3版《王海燕腎臟病學(xué)》血磷高于1.46mmoL/L為高磷血癥。)、高甲狀旁腺素a組(甲狀旁腺素1-34濃度為10-11moL/L)、高甲狀旁腺素b組(甲狀旁腺素1-34濃度為10-10moL/L)；培養(yǎng)基培養(yǎng)14d，檢測BMP-2及Runx-2表達(dá)。

1.2茜素紅染色觀察各組鈣沉積情況：血管平滑肌細(xì)胞接種到9孔板中，按照實(shí)驗(yàn)分組給予干預(yù)措施，培養(yǎng)14d。棄去上清，PBS沖洗3次，4%甲醛于4℃固定10min，PBS沖洗3次，放入濃度為1%、pH值為4.2的茜素紅溶液內(nèi)染色20min，雙蒸水沖洗，濾紙吸干后酒精脫水，相差顯微鏡下觀察并拍照。觀察到橘紅色結(jié)節(jié)為鈣鹽沉積的陽性表現(xiàn)。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測各組BMP-2、Runx-2基因表達(dá)：25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞，PBS沖洗3次，使用TRIzol試劑盒，按照試劑盒說明書提取總的細(xì)胞RNA，測濃度。取RNA1μg，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄出cDNA。取cDNA作為PCR擴(kuò)增模板，按照說明書配反應(yīng)體系，以GAPDH為內(nèi)參基因。引物序列：①BMP-2,forward GGG ACC CGC TGT CTT CTA GT and reverse TCA ACT CAA ATT CGC TGA GGA C;②Runx-2,forward GAC TGT GGT TAC CGT CAT GGC and reverse ACT TGG TTT TTC ATA ACA GCG GA;③GAPDH,forward AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG and reverse AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC.

1.4Western blotting檢測各組細(xì)胞BMP-2、Runx-2蛋白表達(dá):75cm2培養(yǎng)瓶各組血管平滑肌細(xì)胞，PBS洗滌3次，應(yīng)用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，BCA試劑盒測定蛋白含量。12.5%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白組分，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉60min，沖洗后于一抗孵育液內(nèi)4℃過夜，TBST洗滌3次，與二抗(1∶5000)混勻，室溫孵育60min。一抗?jié)舛龋篴nti-BMP2(1∶1000),anti-Runx2(1∶1000)and anti-β-actin(1∶5,000)。

1.5各組血管平滑肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣含量測定：血管平滑肌細(xì)胞接種到6孔板中，按照實(shí)驗(yàn)分組給予干預(yù)措施，培養(yǎng)14d。細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，加入5mLPBS沖洗混勻細(xì)胞，移入離心管后4℃ 1000轉(zhuǎn)/min離心5min，移去上清液。加入200μL裂解液，轉(zhuǎn)入離心管，震蕩15s，于冰槽內(nèi)靜置30min后，4℃ 13000轉(zhuǎn)/min離心5min，移去上清液至1.5mL離心管，吸取10μL用細(xì)胞鈣離子定量試劑盒測定，酶標(biāo)儀波長為570nm。

2 結(jié) 果

2.1茜素紅染色檢測各組細(xì)胞鈣沉積(圖1):空白對照組(control組)與高甲狀旁腺素a組和b組未見鈣化表現(xiàn)；高磷濃度組(HP組)血管平滑肌細(xì)胞被染成深紅色，提示存在細(xì)胞鈣化。

圖1 PTHa和PTHb兩種甲狀旁腺素病理濃度組的細(xì)胞形態(tài)與control組比較，無變化，仍具有收縮型血管平滑肌細(xì)胞的長梭形或帶狀，并且茜素紅染色無深紅色鈣化結(jié)節(jié)；HP組細(xì)胞形態(tài)已發(fā)生變化，且茜素紅染色發(fā)現(xiàn)橘紅色陽性鈣化結(jié)節(jié)形成。

2.2RT-PCR檢測各組基因表達(dá)(圖2)，Western blot檢測各組蛋白表達(dá)(圖3)：空白對照組與高甲狀旁腺素A組及B組血管平滑肌細(xì)胞BMP-2及Runx-2基因及蛋白表達(dá)量無增加，提示單獨(dú)高甲狀旁腺素?zé)o誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞鈣化的作用；高磷濃度組血管平滑肌細(xì)胞BMP-2及Runx-2基因及蛋白表達(dá)量較對照組及正常磷濃度組明顯增高，提示存在高磷誘導(dǎo)血管平滑細(xì)胞鈣化。

圖2 各組BMP-2和Runx-2基因表達(dá)

圖3 各組BMP-2和Runx-2蛋白水平的表達(dá)

2.3各組細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定結(jié)果：高磷組細(xì)胞內(nèi)鈣水平明顯高于對照組(P=0.008<0.05)，提示高磷可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣異常增高，導(dǎo)致鈣化；高甲狀旁腺素a組與b組血管平滑肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度與對照組無差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定結(jié)果

3 討 論

血管鈣化是一個(gè)主要由血管平滑肌細(xì)胞驅(qū)動的主動過程[4]，包括血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成骨樣細(xì)胞、凋亡以及改變細(xì)胞外基質(zhì)沉積以利于血管平滑肌細(xì)胞遷移等過程，因此該課題選擇人主動脈血管平滑肌細(xì)胞為觀察對象。Runx-2是血管平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的重要調(diào)節(jié)因子，在血管鈣化過程中起關(guān)鍵作用；作為成骨配體的BMP-2既是血管鈣化的標(biāo)志物又是驅(qū)動劑。因此，該課題選擇Runx-2和BMP-2為血管平滑肌鈣化的監(jiān)測指標(biāo)。慢性腎衰竭患者血管平滑肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)的鈣泵表達(dá)減少，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，導(dǎo)致細(xì)胞損傷、凋亡，促進(jìn)鈣化。細(xì)胞內(nèi)鈣水平變化是細(xì)胞鈣化更為敏感的指標(biāo)，因此本研究通過監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)鈣水平來反應(yīng)不同干預(yù)因素對細(xì)胞鈣化的影響。

血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程伴隨著細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：正常血管平滑肌細(xì)胞為收縮型，增殖、遷移能力差，細(xì)胞呈長梭形或者帶狀；當(dāng)血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為分泌型，則胞體增大，失去收縮型時(shí)的梭形或者帶狀，變得不規(guī)則，其合成和遷移能力增強(qiáng)。該課題光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：兩種病理濃度的甲狀旁腺素組細(xì)胞形態(tài)仍為梭形或者帶狀，提示細(xì)胞仍為收縮型，高濃度的甲狀旁腺素未能成功誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；而高磷培養(yǎng)基細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，提示血管平滑肌細(xì)胞已轉(zhuǎn)分化為分泌型，是發(fā)生鈣化的關(guān)鍵步驟。

該課題研究表明：高磷培養(yǎng)基可使血管平滑肌細(xì)胞BMP-2及Runx-2表達(dá)增加，茜素紅發(fā)現(xiàn)高磷培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞鈣沉積。慢性腎衰竭患者腎臟排磷功能減退，因此高磷血癥是慢性腎衰竭患者一種常見的電解質(zhì)紊亂，與慢性腎衰竭患者血管鈣化、心血管事件增加有關(guān)。高血磷時(shí)，磷可通過血管平滑肌細(xì)胞的磷轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，升高細(xì)胞內(nèi)液磷濃度，使細(xì)胞內(nèi)成骨性標(biāo)志物Runx-2和BMP-2表達(dá)增加，進(jìn)而促使血管平滑肌細(xì)胞由收縮型轉(zhuǎn)分化為分泌型的成骨樣細(xì)胞。發(fā)生轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞通過在局部生成促鈣化的環(huán)境和鈣磷沉積的位點(diǎn)等主動促進(jìn)鈣羥基磷灰石結(jié)晶沉積到血管中膜[5]。而細(xì)胞外高磷環(huán)境可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡[6]，產(chǎn)生的凋亡小體可以提供鈣磷沉積的內(nèi)核[7]；同時(shí)高磷的環(huán)境會促使細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，血管平滑肌細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白增加，彈性纖維等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解，提供另一類鈣磷沉積的位點(diǎn)。該研究的價(jià)值在于：證實(shí)了單獨(dú)高磷即能夠誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞鈣化，不需要尿毒癥毒素、高鈣及高甲狀旁腺素等因素參與，因此高磷是血管鈣化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。既往也有文獻(xiàn)支持：即使是腎功能正常的人，短暫的血磷濃度升高可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂；升高的血磷與冠狀動脈鈣化相關(guān)，增加心血管事件和死亡率。

中國人群血甲狀旁腺素濃度區(qū)間為(37.07±14.29)ng/L[8]，按照其摩爾質(zhì)量9500g/moL，換算摩爾濃度的正常范圍為(2.4～5.4)×10-12moL/L；選擇甲狀旁腺素的兩個(gè)病理濃度100pg/mL和1000pg/mL，換算為摩爾濃度分別為1.05×10-11moL/L和1.05×10-10moL/L。因此選擇PTH(1-34)兩組病理濃度分別為高甲狀旁腺素a組10-11moL/L和高甲狀旁腺b組10-10moL/L對血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。兩種病理濃度的甲狀旁腺素水平培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞均未出現(xiàn)鈣化，鈣化相關(guān)蛋白Runx-2和BMP-2的表達(dá)與對照組亦無差異，并且細(xì)胞內(nèi)鈣水平較對照組無變化。

甲狀旁腺素在腎臟可以增加腎小管對鈣離子的重吸收，加強(qiáng)磷的排泄，并使活性維生素D及成纖維細(xì)胞生長因子23生成增加；甲狀旁腺素可以使腸道對鈣和磷的重吸收增加。慢性腎衰竭患者，由于活性維生素D缺乏、低鈣血癥及高磷血癥導(dǎo)致繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)。目前公認(rèn)：繼發(fā)性甲旁亢與慢性腎衰竭患者心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。然而患者體內(nèi)存在眾多的危險(xiǎn)因素，臨床上想要確定單純甲狀旁腺素對心血管疾病的影響是非常困難的[9]。因此有學(xué)者切除尿毒癥大鼠甲狀旁腺，通過皮下植入甲狀旁腺素泵的方式控制血甲狀旁腺素濃度，同時(shí)控制磷攝入，證實(shí)：甲狀旁腺素可以不依賴磷而誘導(dǎo)血管鈣化[3]。但這仍是尿毒癥大鼠體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)，不能排除磷以外的尿毒癥毒素參與血管鈣化形成。而該研究運(yùn)用簡單方法，證實(shí)了：單純甲狀旁腺素不能誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞鈣化，高甲狀旁腺素并非血管鈣化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。甚至有部分基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，甲狀旁腺素通過某些機(jī)制抑制血管鈣化的過程：PTH可增加血管平滑肌細(xì)胞cAMP的產(chǎn)生、促進(jìn)鈣外流，導(dǎo)致血管擴(kuò)張；甲狀旁腺素可通過蛋白激酶A和蛋白激酶C活性，增加一氧化氮合成酶的表達(dá)，使得血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮增多，舒張血管；甲狀旁腺素可通過抑制BMP2-Msx2-Wnt信號通路預(yù)防血管鈣化。

隨著認(rèn)識的深入，目前公認(rèn)為高磷血癥是慢性腎臟病血管鈣化的中心環(huán)節(jié)。因此臨床工作中，需重視管理慢性腎臟病患者高磷血癥。