柚皮苷調節(jié)PERK/eIF2α/ATF4/CHOP軸對甲狀腺癌細胞增殖凋亡遷移侵襲的影響

韋 麗， 張建軍， 吳 鋒， 劉宋芳， 楊世峰

(1.陜西省寶雞市人民醫(yī)院內分泌糖尿病科， 陜西 寶雞 721000 2.陜西省西安市第九醫(yī)院內分泌科， 陜西 西安 710000 3.西安交通大學第一附屬醫(yī)院腎內科， 陜西 西安 710000)

甲狀腺癌是常見的內分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，女性約占發(fā)病人數的75%，近年來，該病發(fā)病率逐年增加，死亡率趨于穩(wěn)定。中國為甲狀腺癌高發(fā)地區(qū)，每年甲狀腺癌新增及死亡病例約占全球15%，嚴重威脅我國居民生命安全[1]?，F(xiàn)代藥理學表明，中藥有效成分可抑制甲狀腺癌的疾病進展，且治療途徑廣泛、對患者副作用小[2]。柚皮苷是天然類黃酮化合物，能夠保護心血管、抗氧化應激、抗炎和抗動脈粥樣硬化，且其在食管癌小鼠中具有良好的抗腫瘤活性。研究顯示，柚皮苷可促進化療敏感性，柚皮苷聯(lián)合紫杉醇治療能夠增強對前列腺癌細胞的毒性，抑制癌細胞增殖、轉移，提示柚皮苷單獨或聯(lián)合紫杉醇可用于治療前列腺癌[3]。內質網中營養(yǎng)、鈣、氧及能力狀態(tài)被破壞稱內質網應激，內質網應激可激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，促進腫瘤生長[4]，蛋白激酶R樣內質網激酶/真核生物起始因子2α/活化轉錄因子4/CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(protein kinase R-like ER kinase/Eukaryotic translation initiation factor alpha 2/activating transcription factor 4/CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，PERK-eIF2α-ATF4-CHOP)軸在內質網應激中起重要作用，可通過上調CHOP、Bcl-2和其他細胞凋亡相關因子誘導細胞凋亡[5]。本研究于2019年12月至2021年8月利用柚皮苷處理甲狀腺癌B-CPAP細胞，探討其通過PERK/eIF2α/ATF4/CHOP軸對B-CPAP細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料及儀器：人甲狀腺癌細胞株B-CPAP由中國醫(yī)學科學院提供，柚皮苷(批號：110722-201815，純度≥98%，規(guī)格：20mg)購自中國Beyotime公司，胎牛血清(貨號：12664025)購自美國Gibco BRL公司，ECL化學發(fā)光試劑盒(貨號：abs920)購自愛必信(上海)生物科技有限公司，MTT試劑(貨號：M8180)購自北京索萊寶科技有限公司，Annexin-V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：A9210)購自德國默克公司，p-PERK單克隆抗體(貨號：AP328)、p-eIF2α單克隆抗體(貨號：AF5803)購自上海碧云天生物技術有限公司，PERK單克隆抗體(貨號：ab229912)、eIF2α單克隆抗體(貨號：ab169528)、ATF4單克隆抗體(貨號：ab184909)、CHOP單克隆抗體(貨號：ab11419)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 related X protein，Bax)單克隆抗體(貨號ab32503)、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)單克隆抗體(貨號ab32124)、細胞波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(貨號ab92547)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)單克隆抗體(貨號ab231303)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)單克隆抗體(貨號ab76011)、GAPDH單克隆抗體(貨號：ab8245)均購自艾博抗(上海)貿易有限公司。酶標儀(型號：Multiskan FC)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，流式細胞儀(型號：CytoFLEX)購自美國貝克曼庫爾特有限公司，恒溫培養(yǎng)箱(型號：BPH-9042)購自蘇州貝銳儀器科技有限公司。

1.2方 法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組：取出凍存的B-CPAP細胞，融化后置于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中培養(yǎng)，37℃、5% CO2條件下孵育。于B-CPAP細胞生長至對數生長期時，加入不同濃度的柚皮苷(1、5、10、20μmoL/L)處理，并以不加柚皮苷的B-CPAP細胞為對照組，另采用PERK抑制劑GSK2606414(5μmoL/L)+20μmoL/L柚皮苷處理B-CPAP細胞作為抑制劑組。

1.2.2MTT檢測細胞增殖：將B-CPAP細胞接種至96孔板(20000個/孔)中，收集不同濃度(1、5、10、20μmoL/L)柚皮苷處理48h的B-CPAP細胞，及20μmoL/L柚皮苷處理12、24、48h的B-CPAP細胞，PBS沖洗后，向每孔加入MTT 100μL，37℃孵育，并向每孔加入二甲基砜150μL，低速震蕩10min，采用酶標儀檢測各組B-CPAP細胞570nm處吸光值。B-CPAP細胞增殖率=柚皮苷處理組細胞吸光值/對照組細胞吸光值。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡：采用Annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測各濃度B-CPAP細胞凋亡率。B-CPAP細胞經不同濃度柚皮苷處理48h后，經PBS洗滌，加入500μL結合緩沖液重懸，并加入FITC標記的Annexin V 5μL和PI 5μL，孵育30min(室溫、避光)，采用流式細胞儀檢測各組B-CPAP細胞凋亡率。

1.2.4細胞劃痕實驗：在6孔板中培養(yǎng)各組B-CPAP細胞，細胞密度為1×106個/孔，在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h(37℃、5% CO2)，使用100μL槍頭垂直劃出兩條直線，測定此時劃痕面積(0h時劃痕面積)，藥物作用48h后拍照，倒置顯微鏡觀察各組B-CPAP細胞遷移情況，并測量48h劃痕面積。劃痕愈合率(%)=(0h劃痕面積-48h后劃痕面積)/0h劃痕面積×100%。

1.2.5Transwell實驗：B-CPAP細胞經不同濃度柚皮苷處理48h后，使用Transwell試劑盒觀察各組B-CPAP細胞侵襲能力。采用胰酶消化細胞，PBS清洗1-2次，無BSA培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞密度至1×105個/mL，向Transwell小室(Matrigel基質膠預先包被)上下室分別加入150μL細胞懸液、含BSA培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，乙醇固定5min，結晶紫染色，倒置顯微鏡觀察各組穿膜細胞數。

1.2.6Western blot法檢測蛋白表達：收集不同濃度柚皮苷處理48h后的B-CPAP細胞，使用RIPA裂解液充分裂解，收集細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取50mg蛋白在12%的SDS-PAGE中分離，將其轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2h，加入稀釋(1∶1000)后的對應一抗4℃孵育過夜，加入稀釋(1∶2000)后的二抗孵育2h，ECL試劑盒顯影，Image J軟件分析。

2 結 果

2.1柚皮苷對B-CPAP細胞增殖的影響：與對照組相比，經1、5、10、20μmoL/L柚皮苷處理48h后，B-CPAP細胞增殖率依次下降，呈濃度依賴性(P<0.05)，20μmoL/L柚皮苷的下降效果最明顯；與20μmoL/L相比，抑制劑組B-CPAP細胞增殖率升高(P<0.05)；20μmoL/L柚皮苷處理12h、24h、48h，B-CPAP細胞增殖率依次下降，呈時間依賴性(P<0.05)。見表1、表2。

表1 不同濃度柚皮苷處理48h后B-CPAP細胞增殖情況

表2 20μmoL/L柚皮苷處理不同時間后B-CPAP細胞增殖情況

2.2柚皮苷對B-CPAP細胞凋亡的影響：1、5、10、20μmoL/L柚皮苷處理的B-CPAP細胞凋亡率均高于對照組(P<0.05)，隨柚皮苷濃度的遞增，B-CPAP細胞凋亡率增加，呈濃度依賴性(P<0.05)；抑制劑組B-CPAP細胞凋亡率低于20μmoL/L組(P<0.05)。見圖1、表3。

表3 不同濃度柚皮苷處理48h后B-CPAP細胞凋亡情況

圖1 柚皮苷對B-CPAP細胞凋亡的影響

2.3柚皮苷對B-CPAP細胞遷移的影響：B-CPAP細胞劃痕愈合率隨柚皮苷濃度的遞增而減少，呈濃度依賴性(P<0.05)；抑制劑組B-CPAP細胞劃痕愈合率高于20μmoL/L組(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 柚皮苷對B-CPAP細胞遷移的影響(×200)

表4 不同濃度柚皮苷處理48h后B-CPAP細胞遷移情況

2.4柚皮苷對B-CPAP細胞侵襲的影響：B-CPAP穿膜細胞數隨柚皮苷濃度的遞增而減少，呈濃度依賴性(P<0.05)；抑制劑組B-CPAP穿膜細胞數高于20μmoL/L組(P<0.05)。見圖3、表5。

表5 不同濃度柚皮苷處理48h后B-CPAP細胞侵襲情況

圖3 柚皮苷對B-CPAP細胞侵襲的影響(結晶紫染色×400)

2.5柚皮苷對B-CPAP細胞Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響：隨著柚皮苷濃度增加，B-CPAP細胞E-cadherin、Bax蛋白水平逐漸升高，Vimentin、N-cadherin、Bcl-2蛋白水平逐漸降低，呈濃度依賴性(P<0.05)；抑制劑組B-CPAP細胞E-cadherin、Bax蛋白水平均低于20μmoL/L組，Vimentin、N-cadherin、Bcl-2蛋白水平均高于20μmoL/L組(P<0.05)。見圖4、表6。

表6 不同濃度柚皮苷處理48h后B-CPAP細胞Vimentin E-cadherin N-cadherin Bax Bcl-2蛋白水平變化

圖4 柚皮苷對B-CPAP細胞Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

2.6柚皮苷對B-CPAP細胞PERK/eIF2α/ATF4/CHOP軸的影響：隨著柚皮苷濃度增加，B-CPAP細胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平逐漸升高，呈濃度依賴性(P<0.05)；抑制劑組B-CPAP細胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平均低于20μmoL/L組(P<0.05)。見圖5、表7。

表7 不同濃度柚皮苷處理48h后B-CPAP細胞p-PERK/PERK p-eIF2α/eIF2α ATF4 CHOP蛋白水平變化

圖5 柚皮苷對B-CPAP細胞PERK/eIF2α/ATF4/CHOP軸的影響

3 討 論

近年來，全球范圍內甲狀腺癌的發(fā)病率有所增加，甲狀腺癌主要包括三種組織學類型：分化型(乳頭狀和濾泡狀)、未分化型(間變性)和甲狀腺髓樣癌，其中分化型甲狀腺癌約占90%以上[6]。大多數甲狀腺乳頭狀癌患者長期預后良好，但復發(fā)率(約25-35%)較高，因此臨床需對復發(fā)性病變和轉移進行積極治療[7]。

天然植物提取物具有良好的抗腫瘤特性，且不良反應少。柚皮苷是從西柚、葡萄柚等果肉、果皮中提取的天然黃酮類物質，能夠抑制多種腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡、壞死，并呈劑量依賴性[8]。研究顯示，柚皮苷以劑量依賴性方式抑制結直腸癌細胞的增殖，促進Bax蛋白表達并下調Bcl-2蛋白水平，誘導結直腸癌細胞凋亡，還可抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活，可能成為治療結直腸癌的有效藥物[9]。此外，Zhu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷在體外可以顯著抑制人卵巢癌細胞株SKOV3的增殖和遷移，還可以濃度、時間依賴性的方式抑制順鉑耐藥的人卵巢癌株SKOV3/CDDP的增殖，其逆轉機制可能與NF-κB、E-cadherin通路有關。本研究亦顯示，隨柚皮苷濃度的遞增，B-CPAP細胞增殖率依次下降，細胞凋亡率增加，B-CPAP細胞劃痕愈合率、穿膜細胞數減少，E-cadherin、Bax蛋白水平逐漸升高，Vimentin、N-cadherin、Bcl-2蛋白水平逐漸降低，均呈濃度依賴性；20μmoL/L柚皮苷處理12h、24h、48h，B-CPAP細胞增殖率依次下降，呈時間依賴性，提示柚皮苷可抑制B-CPAP細胞增殖、促進其凋亡，并具有濃度和時間依賴性，且能夠降低B-CPAP細胞的遷移、侵襲能力。

內質網是一種重要的細胞器，其功能受損可引起內質網應激反應。在內質網應激反應的早期階段，為保護正常的細胞功能，主要的反應是阻止未折疊蛋白的合成或促進正確的蛋白折疊；當適應性反應不能克服應激時，細胞內的凋亡途徑就會被激活。內質網通過激活UPR保護細胞免受損害，而UPR與細胞暴露于不利條件(例如輻射)的持續(xù)時間有關，時間不同可能會產生不同的結果，如細胞適應壓力或凋亡[11]。適當的UPR旨在降低內質網容量和蛋白質合成，使細胞適應壓力，然而，在適應性反應不足的情況下，內質網應激會誘導細胞凋亡并激活CHOP、JNK、Bcl-2的表達。內質網應激可激活內質網應激傳感器PERK表達，從而誘導CHOP的轉錄，即上調PERK/ATF4/CHOP通路并促進細胞凋亡。激活的PERK會引發(fā)UPR相關的促凋亡信號，提高磷酸化eIF2α水平，通過ATF4激活適應性信號通路，抑制全局蛋白質合成和選擇性翻譯；而ATF4表達增加可提高CHOP表達水平，CHOP過表達可下調Bcl-2表達，上調Bax水平，并誘發(fā)細胞凋亡。此外，CHOP還可通過另一種促凋亡機制發(fā)揮作用，通過直接激活生長停滯和DNA損傷誘導蛋白GADD34，促進eIF2α的去磷酸化并重新啟動受壓力細胞的蛋白質翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，在異丙腎上腺素誘導的心肌損傷模型中，活性氧(ROS)過量從而觸發(fā)內質網應激損傷，附子靈可通過PERK/eIF2α/ATF4/Chop通路抑制ROS觸發(fā)的內質網應激，防止心肌細胞凋亡[12]。本研究結果顯示，隨著柚皮苷濃度增加，B-CPAP細胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平逐漸升高，呈濃度依賴性；添加PERK抑制劑可降低B-CPAP細胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達，抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP途徑，從而逆轉柚皮苷對B-CPAP細胞的增殖、遷移、侵襲抑制及凋亡促進作用，與Albayrak等[13]研究相似，提示柚皮苷可能通過引發(fā)內質網應激，激活PERK/eIF2α/ATF4/CHOP凋亡途徑，從而影響甲狀腺癌B-CPAP細胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲過程。

綜上所述，柚皮苷能可能通過激活PERK/eIF2α/ATF4/CHOP軸抑制B-CPAP細胞增殖、促進其凋亡，降低B-CPAP細胞遷移、侵襲能力。