LYN通過AKT/mTOR信號(hào)通路對胃癌細(xì)胞增值及凋亡的影響

蘇 銳， 李英健， 劉 鵬， 趙恩宏

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科， 河北 承德 067000)

LYN是Src家族酪氨酸激酶(SFK)的成員，SFK是眾多信號(hào)途徑的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中間體，這些信號(hào)途徑參與細(xì)胞多種生理功能，如增殖、分化、自噬和細(xì)胞凋亡[1]。本研究利用臨床驗(yàn)證的手段分析LYN在胃癌中的表達(dá)，然后通過降表達(dá)LYN觀察其對胃癌細(xì)胞系生物學(xué)表型的影響，明確LYN在胃癌中的生物學(xué)功能，包括增殖和凋亡等，分析LYN對胃癌的調(diào)控機(jī)制。以期為研究胃癌的惡性進(jìn)展機(jī)制和我國胃癌患者的個(gè)體化、精準(zhǔn)化治療提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料:收集73例我院2017年1月至2018年5月接受外科手術(shù)的胃癌患者組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本。

1.2主要試劑、儀器及細(xì)胞株:人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS購自上海中科院細(xì)胞庫，血清來自美國Gibco公司；Lipofectamine2000脂質(zhì)體來自Invitrogen公司；BCA蛋白定量試劑盒BCA Protein Assay Kit來自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；蛋白Marke來自TaKara公司；ECL顯影液來自美國PTG公司；CCK8-kit來自北京索萊寶公司；相關(guān)一抗及二抗來自美國Sigma公司；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱來自Eppendorf公司；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀來自北京六一電泳儀器廠；YD-AB生物組織攤烤片機(jī)來自益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司；4℃/-20℃/-80℃冰箱來自青島海爾公司；iMark多功能酶標(biāo)儀來自Bio.Red公司。

1.3免疫組化方法檢測LYN在胃癌及癌旁組織中的表達(dá):組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)處理，脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片。脫蠟、復(fù)水，將組織樣本切片完全覆蓋。孵育一抗、二抗，DAB顯色，復(fù)染、反藍(lán)，再次脫水后封片。40x10倍視野下，每個(gè)樣本選取3～5個(gè)視野進(jìn)行結(jié)果評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：染色強(qiáng)度x染色面積(0～9分)。染色強(qiáng)度：未著色(0分)，輕度染色(1分)，中度染色(2分)，強(qiáng)染色(3分)。陽性染色細(xì)胞所占面積：未著色(0分)，<33%的陽性染色細(xì)胞(1分)，33～66%的陽性染色細(xì)胞(2分)，>66%的陽性染色細(xì)胞(3分)。總分≤4分為陰性，﹥4分為陽性。

1.4胃癌細(xì)胞AGS培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:使用37℃培養(yǎng)液于血清濃度為10%，青霉素濃度為100U/mL，鏈霉素為0.1mg/mL，5%CO2環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)胃癌AGS細(xì)胞，胰酶消化，吹打、清洗，種植到六孔板中至細(xì)胞生長到對數(shù)期時(shí)，使用Lipofectamine2000介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染。分別取250μL無血清無抗生素的培養(yǎng)液稀釋5μg shRNA寡聚物和5μL脂質(zhì)體，輕輕混勻后，將Lipofectamine2000稀釋液滴加到稀釋的shRNA混合液中，輕輕混勻，室溫孵育20min。將混合物(總體積500μL)滴加入培養(yǎng)孔，搖動(dòng)使其分布均勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，更換含血清不含抗生素的完全培養(yǎng)液。隨后即可進(jìn)行后續(xù)的處理和檢測。

1.5CCK8增殖檢測:細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24h后，細(xì)胞密度在70～80%之間。六孔板每孔接種1×106常規(guī)培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱中，每孔加10μL CCK8試劑后，每24h檢測一次細(xì)胞增殖活力。酶標(biāo)儀設(shè)置450nm波長，檢測各孔溶液的吸光度值。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率:取轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48h的細(xì)胞，加入胰酶消化，離心，PBS洗滌后加入400μL緩沖液，5μL Annexin V-FITC染色液，8℃孵育15min;加10μlPI染色液，8℃孵育15min。流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染48h后，細(xì)胞的凋亡情況。

1.7Western blot檢測細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá):將六孔板置于冰上，加RIPA裂解液(加蛋白酶抑制劑)裂解提取蛋白，BCA法測定濃度，95℃加熱5min。TBST溶液清洗膜3次，每次10min。清洗完成后，吸水紙吸干膜表面水分。PVDF膜上滴ECL反應(yīng)液后，在凝膠成像系統(tǒng)下顯影并成像，并用ImageJ軟件定量蛋白條帶密度，計(jì)算各蛋白表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1LYN在胃癌與癌旁組織中的表達(dá)情況:免疫組織化學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在73例胃癌組織樣本中，LYN高表達(dá)的樣本量為58例，占所有樣本量的79.5%。而在同樣73例癌旁組織樣本中，LYN高表達(dá)的樣本量僅為28例，占所有樣本量的38.4%。兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。分析結(jié)果表明，與正常的胃上皮組織相比，LYN蛋白水平在胃癌組織中顯著高表達(dá)。

表1 胃癌組織與癌旁組織中LYN表達(dá)差異n(%)

2.2LYN的臨床價(jià)值:LYN在胃癌組織中的表達(dá)與患者的病理分級(jí)及分期顯著相關(guān)(P<0.05)。而與患者的性別、年齡、腫瘤大小等因素?zé)o關(guān)。見表2。

表2 胃癌患者LYN表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性研究n(%)

2.3敲低LYN后對AGS細(xì)胞的增殖的影響:CCK-8法檢測LYN敲低后胃癌細(xì)胞的增值情況。研究結(jié)果可見sh-LYN轉(zhuǎn)染48h和72h后，轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞在450nm波長下的吸光度值(0.0992±0.0346)和(1.0953±0.0379)，明顯低于NC組的(1.4123±0.1161)和(1.6717±0.012)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。該結(jié)果表明，LYN的表達(dá)下調(diào)顯著抑制了AGS細(xì)胞的增殖。

2.4敲低LYN的表達(dá)后，可以增強(qiáng)AGS細(xì)胞的凋亡：流式細(xì)胞儀檢測LYN表達(dá)下調(diào)對AGS細(xì)胞凋亡的影響。使用熒光素(fluorescein isothiocyanate,FTTC)標(biāo)記的Annexin V來結(jié)合標(biāo)記早期凋亡的細(xì)胞。碘化丙咤(propidium iodide,PI)標(biāo)記期凋亡中晚細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2A顯示，LYN敲低后，凋亡細(xì)胞的比例顯著高于NC對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。我們又利用蛋白印跡分析檢測了LYN表達(dá)下調(diào)對AGS細(xì)胞凋亡的影響，如圖2B所示，檢測結(jié)果和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果一致，轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05)。同時(shí)我們還利用蛋白印跡分析檢測了細(xì)胞凋亡相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，如圖2C和2D所示：NC組細(xì)胞Bcl2蛋白的相對表達(dá)水平為1.000±0.0577，Bax蛋白的相對表達(dá)水平為1.000±0.0289，Caspase-9蛋白的相對表達(dá)水平為1.000±0.0635，Caspase-3蛋白的相對表達(dá)水平為1.000±0.0462；而sh-LYN組細(xì)胞Bcl2蛋白的相對表達(dá)水平為0.4629±0.0294，Bax蛋白的相對表達(dá)水平為1.407±0.0528，Caspase-9蛋白的相對表達(dá)水平為1.520±0.1063，Caspase-3蛋白的相對表達(dá)水平為1.417±0.0751。相比于NC對照組，sh-LYN敲低LYN的表達(dá)之后，Bcl2的表達(dá)量下降，而Bax，Caspase-9及Caspase-3表達(dá)上升(P<0.05)。

圖2 敲低LYN對AGS細(xì)胞凋亡的影響

2.5敲低LYN的表達(dá)可抑制AKT/mTOR信號(hào)通路：蛋白印跡分析調(diào)查LYN敲低對AKT/mTOR轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果如圖3所示，NC組細(xì)胞p-AKT蛋白的相對表達(dá)水平為1.000±0.0578，p-mTOR蛋白的相對表達(dá)水平為1.000±0.0693，p70S6K蛋白的相對表達(dá)水平為1.000±0.0808；而sh-LYN組細(xì)胞p-AKT蛋白的相對表達(dá)水平為0.5565±0.0473，p-mTOR蛋白的相對表達(dá)水平為0.6167±0.0459，p70S6K蛋白的相對表達(dá)水平為0.6049±0.0570。LYN的敲低導(dǎo)致AGS細(xì)胞內(nèi)p-AKT(Ser473)，p-mTOR和p70S6K的表達(dá)水平降低，而AKT和mTOR的表達(dá)則不受影響。相比于NC對照組，敲低LYN的表達(dá)后AGS細(xì)胞中p-AKT,p-mTOR以及P70的水平顯著降低(P<0.05),而AKT和mTOR的表達(dá)沒有明顯變化。

圖3 敲低LYN抑制了AGS細(xì)胞內(nèi)AKT/mTOR信號(hào)通路的激活

2.6miR-496對LYN的表達(dá)調(diào)控：TARGETSCAN軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-496能夠結(jié)合LYN的3’UTR區(qū)域(圖4A)。我們之前的研究表明，MiR-496在胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[2]。本次實(shí)驗(yàn)AGS細(xì)胞中過表達(dá)miR-496后，檢測LYN的蛋白表達(dá)水平，western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-496后，LYN的蛋白水平明顯下降(P<0.05，圖4B)，說明miR-496能抑制LYN的表達(dá)。

圖4 MiR-496抑制胃癌細(xì)胞中LYN的表達(dá)

3 討 論

胃癌目前是全球第五大常見腫瘤，發(fā)病及死亡率高。圍手術(shù)期輔助和姑息性化療的引入提高了局部進(jìn)展期胃癌的生存率，但是由于腫瘤發(fā)展過程中出現(xiàn)的廣泛浸潤，以及淋巴、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致晚期胃癌的治療仍然很困難[3,4]。LYN的表達(dá)非常普遍，但主要是在造血區(qū)室中高水平表達(dá)，參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)途徑。LYN在實(shí)體瘤中的作用最近才得到一些闡明。Adriano的團(tuán)隊(duì)在胃癌樣本中觀察到LYN基因甲基化模式的改變[5]。也就是說，LYN在胃癌中的過度表達(dá)可能是因?yàn)楸碛^遺傳的改變。本研究發(fā)現(xiàn)，LYN在胃癌組織中顯著高表達(dá),我們的結(jié)果也是首次揭露了LYN在胃癌組織中的過度表達(dá)而且LYN的過度表達(dá)影響著胃癌患者的預(yù)后。Zhang等發(fā)現(xiàn)LYN敲低的黑色素瘤細(xì)胞在培養(yǎng)的第3天和第4天的細(xì)胞增值率明顯降低[6]。Meng等的研究團(tuán)隊(duì)利用轉(zhuǎn)基因前列腺癌小鼠模型(TRAMP)發(fā)現(xiàn)LYN對前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移潛能都具有重要意義[7]。但對LYN在胃癌增殖、凋亡中的作用尚不清楚?；诖耍緦?shí)驗(yàn)中通過shRNA轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低LYN的表達(dá)后，相比于對照組，LYN敲低組的細(xì)胞生存率顯著降低，說明敲低LYN的表達(dá)能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖。本研究又進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測敲低胃癌細(xì)胞的LYN表達(dá)之后細(xì)胞凋亡的變化情況，結(jié)果顯示，降表達(dá)LYN能顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。說明了LYN的表達(dá)量與胃癌細(xì)胞的增殖及凋亡顯著相關(guān)。

為了研究降表達(dá)LYN誘導(dǎo)細(xì)胞增值及凋亡的機(jī)制，我們利用蛋白印跡分析，調(diào)查了LYN敲低對AKT/mTOR轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響。PI3K/AKT/mTOR途徑是繼p53途徑之后人類癌癥中第二大最常改變的途徑，在不同類型的腫瘤中觀察到的頻率為30%～60%[8]。當(dāng)PI3K/AKT信號(hào)通路活化時(shí)AKT的磷酸化水平(p-AKT)提高，p-AKT進(jìn)一步磷酸化其下游蛋白mTOR,磷酸化的p-mTOR促進(jìn)其下游蛋白P70的表達(dá)，P70可通過促進(jìn)翻譯來促進(jìn)細(xì)胞的增殖、生存等[9]。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，敲低LYN的表達(dá)后，可使胃癌細(xì)胞中p-AKT,p-mTOR以及P70的水平顯著降低,而對AKT，mTOR的表達(dá)沒有顯著影響，說明LYN敲低表達(dá)可以抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的磷酸化，從而影響胃癌細(xì)胞的增值及凋亡。Bcl-2是抑制凋亡的重要蛋白，Bax則是促凋亡蛋白，Caspase-3和Casapse-9是執(zhí)行細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵酶[10,11]。眾所周知，內(nèi)在的凋亡途徑受到Bcl-2家族蛋白的嚴(yán)格控制，Bcl-2家族蛋白是線粒體外膜通透性(Mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)的主要調(diào)節(jié)劑。有研究顯示，抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可上調(diào)腫瘤中Bax、Caspase-9及Caspase-3的蛋白水平，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低胃癌細(xì)胞中的LYN的表達(dá)之后，Bcl-2的表達(dá)量下降，而Bax、Caspase-9及Caspase-3的表達(dá)量上升，表明LYN表達(dá)敲低可以使凋亡蛋白的表達(dá)向促進(jìn)凋亡的方向調(diào)控。LYN可以通過對上述蛋白的調(diào)節(jié)，調(diào)控胃癌細(xì)胞的凋亡，從而影響細(xì)胞的存活。

miRNA在包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病中發(fā)揮重要作用，其家族成員miR-496也被發(fā)現(xiàn)與多種癌癥相關(guān)。miR-496在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中異常表達(dá)，NSCLC患者細(xì)胞系中miR-496的增加均可顯著抑制細(xì)胞增殖進(jìn)而調(diào)控NSCLC患者的疾病進(jìn)展[12]。研究表明，miRNA可以通過與靶基因的3'UTR的配對，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[13]。我們利用TARGETSCAN分析發(fā)現(xiàn)miR-496與LYN的3'UTR之間發(fā)現(xiàn)了一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，說明LYN可能是miR-496的潛在靶點(diǎn)。western blot實(shí)驗(yàn)對于LYN是miR-496的下游靶點(diǎn)的驗(yàn)證結(jié)果顯示，上調(diào)miR-496 能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞中LYN蛋白水平的表達(dá)。這提示miR-496可能通過與LYN間的相互抑制，影響胃癌細(xì)胞的生長。但是LYN和miR-496在胃癌中的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，LYN在胃癌組織中異常高表達(dá)，敲低其表達(dá)可以通過抑制AKT/mTOR信號(hào)途徑的激活顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖、并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)LYN對胃癌細(xì)胞的這些作用受到miR-496的靶向調(diào)控。這些研究可能為胃癌的靶向治療提供新的理論依據(jù)。