雷米普利通過激活ERK1/2-Cx43信號(hào)通路降低SHR大鼠的血壓

趙 亮， 魏 童

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊 830011)

高血壓是心臟病、腦血管疾病和腎臟疾病最重要的危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重影響現(xiàn)代人類生活質(zhì)量[1]。高血壓的血管病變(如損傷、氧化應(yīng)激和炎癥)可導(dǎo)致血管收縮壓升高[2]。血管緊張素II(Angiotensin,AngII)是一種強(qiáng)大的促炎和血管收縮因子，可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞(SMCs)表型轉(zhuǎn)化并參與血管重塑。雷米普利(ramipril,RMP)是一種關(guān)鍵的血管緊張素的抑制劑，不僅抑制血管緊張素I向血管緊張素Ⅱ的轉(zhuǎn)化，還與內(nèi)源性緩激肽的積累有關(guān)，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管舒張[3]。然而，目前仍缺乏關(guān)于RMP對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)血壓的影響和調(diào)控機(jī)制的研究。縫隙連接(gap junction,GJ)是一種典型的存在于相鄰細(xì)胞之間的膜通道結(jié)構(gòu)，其基本單位稱為連接蛋白(connexins,Cxs)。電或化學(xué)信號(hào)可以通過Cxs從血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入到血管平滑肌細(xì)胞，進(jìn)一步誘導(dǎo)鈣依賴性鉀通道的激活，使細(xì)胞膜超極化，引起血管舒張。目前已鑒定出21種Cxs，其中Cx43的表達(dá)與高血壓關(guān)系最為密切[4]。在血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)的激活促進(jìn)Cx43的磷酸化。另外，已知ERK1/2在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、分化和細(xì)胞周期中發(fā)揮重要調(diào)控作用，ERK1/2的磷酸化的增加可以介導(dǎo)降壓藥maximakinin的降壓功能，且ERK1/2抑制劑U0126還抑制了Cx43的磷酸化[4]。因此，本課題組推測(cè)RMP可改善SHR的血壓，其中ERK1/2磷酸化和Cx43磷酸化介導(dǎo)ERK1/2-Cx43信號(hào)通路激活有關(guān)。因此，本文旨在觀察RMP對(duì)SHR大鼠血壓的作用并探討其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑與耗材:雷米普利(R0404-250 MG，溶解于生理鹽水)購(gòu)于美國(guó)Sigma Aldrich公司。Cx43抑制劑甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)和ERK1/2抑制劑U0126均購(gòu)于美Sigma Aldrich公司。蘇木精伊紅染色試劑盒及BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司。聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜購(gòu)于美國(guó)Millipore公司；脫脂奶粉購(gòu)于美國(guó)BD公司。單克隆鼠抗GAPDH 抗體(TA-08)購(gòu)于北京冷杉金橋生物科技有限公司；多克隆兔抗Cx43，ERK1/2和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，單克隆兔抗磷酸化Cx43抗體p-Cx43(Ser368)購(gòu)于美國(guó)CST公司。二抗購(gòu)于北京金橋生物科技有限公司稀釋劑；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)于英國(guó)GE健保與生命科學(xué)公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:50只成年雄性SHR大鼠(10周齡，300～350g)和10只健康成年雄性wistar大鼠(10周齡，300～350g)購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)大鼠在白天/黑夜交替(12h/12h)的24℃室溫條件下飼養(yǎng)，并提供飲水和食物供自由攝取。本研究的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過我院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過。研究中所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes Of Health,NIH)出版的《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南》(出版物第85-23號(hào)，1996年)進(jìn)行。

1.3動(dòng)物給藥和分組:50只成年雄性SHR大鼠(300～350g)和10只健康成年雄性wistar大鼠(300～350g)購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)大鼠在白天/黑夜交替(12h/12h)的24℃室溫條件下飼養(yǎng)，并提供飲水和食物供自由攝取。SHR大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為SHR組、RMP+SHR組、RMP+甘珀酸[CBX，縫隙連接蛋白43(Cx43)抑制劑]+SHR組、RMP+CBX+U0126[細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)抑制劑)]+SHR組，n=10/組。健康wistar大鼠為control組(n=10)并與SHR組均給予生理鹽水40mL/kg i.v.，其余3組分別給予RMP 10mg/kg i.v.，RMP 10 mg/kg和CBX 13.5mg/kg i.v.，RMP 10 mg/kg和CBX 13.5mg/kg和U012612 mg/kg i.v.，尾靜脈推注。

1.4大鼠動(dòng)脈收縮壓檢測(cè):Control組、SHR組、RMP+SHR組、RMP+CBX+SHR組、RMP+CBX+U0126+SHR組的所有大鼠在給藥48h后，采用BP-6大鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)試儀讀取大鼠動(dòng)脈收縮壓數(shù)值。

1.5大鼠腦組織分離:Control組、SHR組、RMP+SHR組、RMP+CBX+SHR組、RMP+U0126+SHR組、RMP+CBX+U0126+SHR組的大鼠接受戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射，麻醉后迅速處死動(dòng)物。用鉤鑷固定大鼠顱骨，用組織剪分離顱骨和頸椎連接，剪開頭部皮膚，掀開顱骨暴露完整的腦組織，收集腦組織標(biāo)本，將腦組織用冷生理鹽水清洗。分離顱底動(dòng)脈，保存于4℃。

1.6大鼠顱底動(dòng)脈(直徑<400μm)病理觀察:分離Control組、SHR組、RMP+SHR組、RMP+CBX+SHR組、RMP+U0126+SHR組、RMP+CBX+U0126+SHR組的的顱底動(dòng)脈組織后。用含10%福爾馬林的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)固定顱底動(dòng)脈。將固定基底動(dòng)脈脫水，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片，經(jīng)二甲苯I(10 min)和二甲苯II(15 min)脫蠟，再經(jīng)過乙醇[無(wú)水乙醇I(5 min)、無(wú)水乙醇II(5 min)、95%乙醇(2 min)、90%乙醇(2 min)、80%乙醇(2 min)、70%乙醇(2 min)]水化，用蒸餾水洗去乙醇。清洗后切片按試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行蘇木精伊紅(H&E)染色。乙醇脫水分化后，用BX50光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。每個(gè)切片取自6個(gè)不同區(qū)域(200倍放大)，測(cè)量動(dòng)脈血管厚度變化。

1.7Western blot:采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Control組、SHR組、RMP+SHR組、RMP+CBX+SHR組、RMP+U0126+SHR組、RMP+CBX+U0126+SHR組的顱底動(dòng)脈組織中蛋白的濃度。隨后均勻煮沸10min進(jìn)行蛋白變性。將變性后的總蛋白用10%分離凝膠進(jìn)行電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)移至膜。將PVDF膜加入到含有50g/L脫脂奶粉的堵液中，將其置于室溫下的搖床上2h，然后在添加相應(yīng)的一抗GAPDH(1∶1000)，Cx43(1∶1000)，p-Cx43(Ser368)(1∶5000)，ERK1/2(1∶1000)，p-ERK1/2(1∶1000)，第2天，PVDF膜在4℃搖床上孵育2h，然后加入相應(yīng)的二抗(1∶5000)稀釋劑，用1×TBST洗滌3次(10min/次)。添加發(fā)光試劑到暗室中進(jìn)行曝光，并在清洗后留下來(lái)進(jìn)行顯影。使用Quantity One(Bio-Rad)評(píng)估每個(gè)目標(biāo)蛋白條帶的光密度，GAPDH為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié) 果

2.1RMP的降血壓作用:SHR組大鼠呈高血壓癥狀，與Control組比，SHR組的收縮壓從118.25±12.33上調(diào)至178.63±12.64，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，與SHR組比，RMP+SHR組大鼠血壓降低了近30%(均P<0.05)。見圖1。

圖1 RMP對(duì)SHR大鼠的降壓作用

2.2RMP改善SHR大鼠腦動(dòng)脈壁厚度變化:蘇木精-伊紅染色形態(tài)學(xué)分析了大鼠腦動(dòng)脈壁的變化。與Control組比，SHR組大鼠腦動(dòng)脈肥大，并表現(xiàn)為壁厚、管腔直徑、中膜厚度和管腔橫截面面積增加；與SHR組比，RMP+SHR組大鼠上述形態(tài)學(xué)變化明顯減輕。見圖2。

圖2 RMP改善SHR大鼠腦動(dòng)脈壁厚度的影響

2.3RMP激活SHR大鼠體內(nèi)ERK1/2-Cx43信號(hào)通路:觀察ERK1/2-Cx43信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，SHR組p-ERK1/2和p-Cx43的水平都較Control組明顯降低，而ERK1/2和Cx43的表達(dá)差異不明顯(P<0.05)同樣與SHR組比，RMP+SHR組的ERK1/2和Cx43的表達(dá)差異不明顯(P<0.05)，但是p-ERK1/2和p-Cx43表達(dá)水平均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明RMP可激活SHR大鼠體內(nèi)ERK1/2-Cx43信號(hào)通路。見圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)ERK1/2-Cx43信號(hào)通路信號(hào)蛋白的表達(dá)變化

2.4CBX聯(lián)合U0126抑制ERK1/2-Cx43信號(hào)通路的激活:與RMP+SHR組比，RMP+CBX+SHR組p-Cx43表達(dá)降低(均P<0.05)，p-ERK1/2的表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，但RMP+U0126+SHR組p-Cx43和p-ERK1/2的表達(dá)都降低(均P<0.05)。另外，與RMP+CBX+SHR組或RMP+U0126+SHR組比，RMP+CBX+U0126+SHR組的p-Cx43和p-ERK1/2的表達(dá)都降低(均P<0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)ERK1/2-Cx43信號(hào)通路信號(hào)蛋白的表達(dá)變化

2.5阻斷ERK1/2-Cx43信號(hào)通路促進(jìn)血壓升高和腦動(dòng)脈壁增厚:與RMP+SHR組比，RMP+CBX+SHR組和RMP+U0126+SHR組的血壓明顯增高(圖5，均P<0.05)，大鼠腦動(dòng)脈壁增厚嚴(yán)重，表現(xiàn)為壁厚、管腔直徑、中膜厚度和管腔橫截面面積增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6，均P<0.05)。與RMP+CBX+SHR組或RMP+U0126+SHR組比，RMP+CBX+U0126+SHR組的血壓增加(圖5，均P<0.05)，腦動(dòng)脈壁厚增加(圖6，均P<0.05)。

圖5 阻斷ERK1/2-Cx43信號(hào)通路促進(jìn)血壓升高

圖6 阻斷ERK1/2-Cx43信號(hào)通路增加大鼠腦動(dòng)脈壁厚度。H&E染色圖(200X)。#，與SHR比，P<0.05。&，與RMP+SHR比，P<0.05。$，與RMP+CBX+SHR/RMP+U0126+SHR比，P<0.05。SHR：自發(fā)性高血壓大鼠；RMP：雷米普利。CBX：Cx43抑制劑；U0126：ERK1/2抑制劑。

3 討 論

本文研究果表明：①RMP存在下明顯減弱了SHR動(dòng)脈血管壁厚度，從而緩解了血管腔狹窄。②RMP調(diào)控的這些病理變化與動(dòng)物體內(nèi)Cx43的以及ERK1/2的失活相關(guān)，而這些病理變化可被Cx43以及ERK1/2的抑制劑CBX和U0126逆轉(zhuǎn)。

在高血壓中，機(jī)械壓力和血流對(duì)血管壁的影響會(huì)破壞血管內(nèi)皮，從而增加內(nèi)皮的通透性。單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中膜平滑肌細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)膜，正常血管結(jié)構(gòu)消失，從而促使動(dòng)脈血管重構(gòu)的發(fā)生，嚴(yán)重引發(fā)栓塞[5,6]。血管緊張素Ⅱ作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的重要組成部分，參與了高血壓的發(fā)生發(fā)展。下調(diào)血漿血管緊張素Ⅱ水平可延遲或逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)，改善血管舒縮功能，改善血管順應(yīng)性。在動(dòng)脈重構(gòu)過程中，血管同步收縮反應(yīng)受到影響，從而改變血管舒縮功能[7]。RMP作為血管緊張素的抑制劑，不僅抑制血管緊張素I向血管緊張素Ⅱ的轉(zhuǎn)化，還與內(nèi)源性緩激肽的積累有關(guān)，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管舒張。例如，RMP可通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶從而促進(jìn)內(nèi)皮B2激肽受體相關(guān)NO的釋放促進(jìn)血管舒張，另外，RMP可以通過調(diào)控血緊張素轉(zhuǎn)化酶，并阻斷血管緊張素I向血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化的同時(shí)增加血管緊張素(1-7)，從而能減少緩激肽的降解，而血管緊張素(1-7)和緩激肽可協(xié)同促進(jìn)血管舒張[7,8]。本研究觀察到RMP治療SHR后，血壓明顯降低，而動(dòng)脈血管壁厚度同樣隨著RMP的治療而明顯減少。然而，這些變化背后的分子機(jī)制尚不清楚。

研究表明Cx43的水平與血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的表型密切相關(guān)，細(xì)胞因子誘導(dǎo)VSMC收縮表型的轉(zhuǎn)變與VSMC細(xì)胞中Cx43表達(dá)的增加有關(guān)[9]。VSMC的胞外信號(hào)的激活ERK1/2可以促進(jìn)Cx43的磷酸化，而p-Cx43含量的增加則促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的電信號(hào)或化學(xué)信號(hào)傳遞并進(jìn)一步調(diào)節(jié)血管張力，擴(kuò)張血管，降低血壓，添加ERK1/2的抑制劑U0126能有效地阻斷p-Cx43的激活和相應(yīng)的降壓效應(yīng)[4]。另外，Cx43過表達(dá)能促進(jìn)VSMC的增殖和遷移，而且Cx43表達(dá)減少(siRNA-Cx43)則可抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移[3]。一致的是，本研究結(jié)果首先觀察到高血壓動(dòng)物模型中p-ERK1/2和p-Cx43表達(dá)均降低，而RMP治療后p-ERK1/2和p-Cx43的表達(dá)明顯增加，提示ERK1/2和Cx43被激活，而U0126和CBX都可以顯著下調(diào)p-Cx43的表達(dá)(CBX不影響p-ERK1/2的的表達(dá))從而逆轉(zhuǎn)了RMP對(duì)高血壓和動(dòng)脈血管壁增厚的抑制效果。本研究結(jié)果提示RMP通過上游ERK1/2磷酸化激活Cx43，激活Cx43進(jìn)一步促進(jìn)血管舒張，降低血壓。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)是血管緊張素Ⅱ重要的下游靶點(diǎn)，MAPK通路是Cx43相關(guān)功能的關(guān)鍵調(diào)控通路，其中ERK1/2的磷酸化可以激活Cx43[10]。越來(lái)越多的研究報(bào)道ERK1/2信號(hào)與動(dòng)脈血管的重塑和血管壁厚度密切相關(guān)[11]。本研究表明，ERK1/2信號(hào)可以被RMP激活，與此同時(shí)，利用組織學(xué)染色觀察到動(dòng)脈壁厚度明顯減少，而ERK1/2的抑制劑U0126明顯增加了厚動(dòng)脈壁的厚度，降低了Cx43 Ser368位點(diǎn)的磷酸化水平。表明RMP通過調(diào)控ERK1/2信號(hào)通路及下游的Cx43磷酸化從而調(diào)節(jié)大腦動(dòng)脈高血壓和管壁厚度。GJs允許小代謝物和信號(hào)分子(如環(huán)磷酸腺苷和Ca2+)在連接的細(xì)胞之間進(jìn)行穿梭，而不進(jìn)入細(xì)胞外空間[11]。因此，當(dāng)這些連接的細(xì)胞中的一些接收到信號(hào)時(shí)，整個(gè)細(xì)胞群都會(huì)做出反應(yīng)。大腦動(dòng)脈細(xì)胞之間的GJs連接通過影響細(xì)胞分化、遷移和存活在大腦發(fā)育中發(fā)揮作用[12]。研究表明，在高血壓期間，Cx43不僅在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用，還能促進(jìn)血管收縮，增加血管順應(yīng)性，最終導(dǎo)致動(dòng)脈重構(gòu)[13,14]。不僅如此，本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在SHR中Cx43是一個(gè)受多級(jí)信號(hào)調(diào)控的蛋白分子，通過ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的Ser368位點(diǎn)磷酸化，表明Cx43在RMP改善的高血壓和動(dòng)脈血管壁增厚中扮演重要角色。然而，仍需要更多的體外和體內(nèi)高血壓模型來(lái)驗(yàn)證ERK1/2-Cx43信號(hào)介導(dǎo)的SHR維持高血壓的機(jī)制，以及使用類似有RMP作用的藥物激活ERK1/2-Cx43通路的可能的抗高血壓作用。

總之，本研究結(jié)果表明，注射RMP降低SHR的血壓和動(dòng)脈血管壁厚度，激活ERK1/2-Cx43通路。此外，用U0126抑制了ERK1/2-Cx43信號(hào)后明顯減弱了SHR的效果。表明RMP可能具有高血壓治療潛力，進(jìn)一步研究靶向ERK1/2-Cx43信號(hào)的藥物對(duì)于減輕高血壓具有重要意義。