基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的膽黃潤(rùn)腸丸治療慢傳輸型便秘作用機(jī)制研究※

金 瑩 居 羚 黃 瑋 楊洪元 高素琴

慢傳輸型便秘（slow transit constipation,STC）約占便秘的16%～40%，是功能性便秘的常見類型，多見于老年人和女性患者[1]。隨著社會(huì)人口的老齡化，飲食結(jié)構(gòu)的改變以及精神心理和社會(huì)因素的影響[2]，STC發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。由于STC病因復(fù)雜多樣，臨床癥狀頑固，西醫(yī)對(duì)癥、手術(shù)治療效果欠佳[3]。中醫(yī)治療便秘歷史悠久，經(jīng)驗(yàn)豐富。便秘之癥始見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，稱之為“后不利”“大便難”。相關(guān)研究[4]發(fā)現(xiàn)，STC的中醫(yī)證型以氣虛腸燥證、氣陰兩虛證和脾腎陽(yáng)虛證為主，對(duì)STC的中醫(yī)治療具有指導(dǎo)意義?，F(xiàn)代中醫(yī)臨床治療STC 多以通下為主，并輔以生津潤(rùn)腸、益氣健脾等藥進(jìn)行綜合調(diào)理[5]。國(guó)內(nèi)一些學(xué)者采用雙盲、隨機(jī)、安慰劑對(duì)照法對(duì)中藥治療STC的療效和安全性進(jìn)行了驗(yàn)證，并得到了國(guó)際業(yè)內(nèi)人士的肯定[6-8]。

膽黃潤(rùn)腸丸（蘇藥制字Z04001225）由大黃和豬膽膏兩味中藥組成，為江蘇省常州市中醫(yī)醫(yī)院全國(guó)名老中醫(yī)周玉祥教授遵循“六腑以通為用”“六腑以通為補(bǔ)”的治則而擬的臨證經(jīng)驗(yàn)方，具有潤(rùn)腸通便、清熱解毒的功效，臨床適用于痔瘡手術(shù)及便秘等病癥，對(duì)老年功能性便秘效果尤佳[9]。該院內(nèi)制劑已有50 余年的創(chuàng)方史及臨床應(yīng)用基礎(chǔ)，因處方組成精練、制劑工藝簡(jiǎn)易、患者服用方便，有著良好的臨床療效和應(yīng)用前景。江蘇省常州市中醫(yī)醫(yī)院前期雖對(duì)該特色制劑開展了一系列的臨床療效觀察、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高和藥理實(shí)驗(yàn)等研究工作[10-16]，但獲得的信息較為片面，無(wú)法系統(tǒng)全面地闡明膽黃潤(rùn)腸丸的作用機(jī)制。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)膽黃潤(rùn)腸丸所含藥物的多成分、多靶點(diǎn)和疾病之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行研究，為揭示膽黃潤(rùn)腸丸治療STC的作用機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 膽黃潤(rùn)腸丸活性成分的篩選用關(guān)鍵詞“大黃”檢索中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)TCMSP（https://tcmsp-e.com），以口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18作為大黃活性成分的篩選標(biāo)準(zhǔn)[17]，采集大黃活性成分的基本屬性信息，點(diǎn)擊活性成分結(jié)構(gòu)式獲得mol2文件備用。在中國(guó)知網(wǎng)CNKI（https://www.cnki.net）檢索豬膽粉相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]獲得主要成分化學(xué)名，利用有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）確定豬膽粉主要成分的結(jié)構(gòu)式及基本參數(shù)，依據(jù)Lipinski五規(guī)則[20]：分子量（MW）＜500、氫鍵給體數(shù)目（Hdon）＜5、氫鍵受體數(shù)目（Hacc）＜10、脂水分配系數(shù)（AlogP）＜5、可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量（RBN）＜10篩選出豬膽粉的活性成分，并下載有效化合物的sdf 文件備用。

1.2 膽黃潤(rùn)腸丸活性成分潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)匯總大黃活性成分的mol 2文件與豬膽粉活性成分的sdf文件，借助藥效團(tuán)匹配與潛在識(shí)別靶標(biāo)平臺(tái)PharmMapper（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/）預(yù)測(cè)膽黃潤(rùn)腸丸活性成分的潛在靶點(diǎn)。靶標(biāo)選擇“Human Protein Targets Only”，獲取大黃與豬膽粉活性成分的csv文件后，以Norm Fit＞0.9作為有效靶點(diǎn)的篩選條件，并通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot（https://www.uniprot.org)進(jìn)一步規(guī)范靶點(diǎn)基因名，將其校正為官方名。

1.3 構(gòu)建膽黃潤(rùn)腸丸“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)將大黃和豬膽粉有效靶點(diǎn)的基因信息整理為膽黃潤(rùn)腸丸的network文件和type文件，利用生物信息分析軟件Cytoscape 3.7.1 構(gòu)建膽黃潤(rùn)腸丸的“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值（Degree）調(diào)整圖標(biāo)尺寸和顏色深淺，并將活性成分節(jié)點(diǎn)按度值大小順序排列。

1.4 慢傳輸型便秘關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)與“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)篩選用關(guān)鍵詞“slow transit constipation”檢索在線《人類孟德爾遺傳》數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM（https://omim.org）和人類基因綜合數(shù)據(jù)庫(kù)Genecards（https://www.genecards.org），兩庫(kù)篩選得到的靶點(diǎn)進(jìn)一步整合去重即為STC 的關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)。將膽黃潤(rùn)腸丸和慢傳輸型便秘關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)上傳在線平臺(tái)Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny），獲得“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)及韋恩圖。

1.5 構(gòu)建“化合物-疾病”交集靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）應(yīng)用蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)STRING（https://www.string-db.org）構(gòu)建交集靶點(diǎn)的互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），“Multiple proteins”菜單欄輸入“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)列表，“Organism”項(xiàng)選擇“Homo sapiens”，“medium confidence”設(shè)置為0.4，獲得“化合物-疾病”交集靶點(diǎn)PPI。將下載的tsv 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件，根據(jù)靶點(diǎn)相互作用的度值重新布局“化合物-疾病”交集靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)。

1.6 GO 和KEGG 通路富集分析應(yīng)用Metascape（https://www.metascape.org）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）的富集分析，輸入“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)列表，“Input as species”選擇“H.sapiens”，點(diǎn)擊“Custom Analysis”進(jìn)入Enrichment 菜單頁(yè)，“P Value Cutoff”設(shè)置為0.01，分別對(duì)KEGG 和GO 進(jìn)行富集分析?！癆nalysis Report Page”頁(yè)截取GO 通路信息，借助生信結(jié)果作圖網(wǎng)站微生信（http://www.bioinformatics.com.cn）制作GO 富集BP、MF、CC三合一柱狀圖，以及KEGG富集氣泡圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽黃潤(rùn)腸丸活性成分篩選結(jié)果TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到大黃成分92個(gè)，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得大黃活性成分16 個(gè)，詳見表1。因TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)尚未收載豬膽粉品種信息，故采用自主建庫(kù)模式篩選該中藥的活性成分。檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，豬膽粉含有結(jié)合型膽酸、游離型膽酸、膽色素和氨基酸等19種主要成分。依據(jù)Lipinski五規(guī)則篩選PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)豬膽粉成分基本參數(shù)，共獲得豬膽粉活性成分8個(gè)，詳見表2。

表1 大黃有效化合物基本信息表

表2 豬膽粉有效化合物基本信息表

2.2 膽黃潤(rùn)腸丸活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果以Norm Fit＞0.9 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，借助PharmMapper 平臺(tái)共得到大黃潛在靶點(diǎn)421 個(gè)、豬膽粉潛在靶點(diǎn)189 個(gè)。通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot 的Retrieve/ID mapping 功能進(jìn)一步規(guī)范潛在靶點(diǎn)的基因名，去重后最終獲得膽黃潤(rùn)腸丸活性成分潛在靶點(diǎn)97個(gè)。

2.3 構(gòu)建膽黃潤(rùn)腸丸“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)利用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建膽黃潤(rùn)腸丸的“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，如圖1所示，該網(wǎng)絡(luò)共包含123個(gè)節(jié)點(diǎn)（2個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)、24個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)和97個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和634 條邊。其中，正方形為藥物圖標(biāo)，圓形為活性成分圖標(biāo)，菱形為靶點(diǎn)圖標(biāo)。節(jié)點(diǎn)度值（degree）越大，圖標(biāo)越大，顏色越深，度值前五的靶點(diǎn)分別為CA2（degree=22）、PIM1（degree=18）、STS（degree=18）、TTR（degree=18）、PPIA（degree=17）。

圖1 膽黃潤(rùn)腸丸“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 慢傳輸型便秘關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)與“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)篩選結(jié)果用關(guān)鍵詞“slow transit constipation”檢索OMIM和Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)，去重后得到STC相關(guān)靶點(diǎn)1005個(gè)。借助在線平臺(tái)Venny 2.1繪制膽黃潤(rùn)腸丸與STC 交集靶點(diǎn)韋恩圖，共得到“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)38個(gè)，詳見圖2。與交集靶點(diǎn)密切相關(guān)的藥物活性成分主要為原花青素B-5,3'-O-沒食子酸酯、番瀉甙D、大黃素甲醚雙葡萄糖甙和豬膽酸等。

圖2 膽黃潤(rùn)腸丸-慢傳輸型便秘交集靶點(diǎn)圖

2.5 構(gòu)建“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）應(yīng)用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，可知該網(wǎng)絡(luò)由38 個(gè)節(jié)點(diǎn)、211 條邊組成，平均節(jié)點(diǎn)度值為11.1。借助Cytoscape 3.7.1 重新布局交集靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，如圖3所示，度值（degree）越大則節(jié)點(diǎn)圖標(biāo)越大，相互作用越強(qiáng)則節(jié)點(diǎn)連線越粗。由圖可見，該互作網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)分別為：ALB（degree=32）、EGFR（degree=26）、CASP3（degree=25）、ESR1（degree=23）、HSP90AA1（degree=20）。

圖3 膽黃潤(rùn)腸丸-慢傳輸型便秘交集靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 “藥物-疾病”交集靶點(diǎn)GO 和KEGG 通路富集分析結(jié)果應(yīng)用Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行膽黃潤(rùn)腸丸與慢傳輸型便秘38 個(gè)交集靶點(diǎn)的GO 和KEGG 富集分析，并通過(guò)微生信可視化平臺(tái)在線作圖。由GO 富集分析圖（圖4）可見，生物過(guò)程（Biological process，BP）包括類固醇激素的反應(yīng)、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)等；細(xì)胞組分（Cellular component，CC）包括囊泡腔、膜筏、軸突等；分子功能（Molecular function，MF）包括蛋白激酶結(jié)合、蛋白域特異性結(jié)合、核受體活性等。由KEGG 氣泡圖（圖5）可見，膽黃潤(rùn)腸丸治療STC主要涉及癌癥通路、IL-17信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等。

圖4 膽黃潤(rùn)腸丸-慢傳輸型便秘交集靶點(diǎn)GO富集分析圖

圖5 膽黃潤(rùn)腸丸-慢傳輸型便秘交集靶點(diǎn)KEGG氣泡圖

3 討論

大黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷來(lái)為通下要藥，因其藥性“勁利”“駿快”，被陶弘景譽(yù)為“將軍”[21]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，大黃致瀉成分主要為蒽醌類和蒽酮類。未被小腸吸收的結(jié)合型蒽醌被大腸內(nèi)細(xì)菌酶水解為蒽酮或蒽酚，一方面通過(guò)刺激大腸黏膜和腸壁肌層內(nèi)神經(jīng)叢，促進(jìn)腸道平滑肌收縮而導(dǎo)瀉；另一方面通過(guò)抑制腸細(xì)胞膜上Na+-K+-ATP酶，使腸內(nèi)滲透壓升高，而引起容積性瀉下。同時(shí)，部分蒽苷由小腸吸收后轉(zhuǎn)化為苷元，再經(jīng)大腸或膽囊分泌入腸腔而致瀉[22-24]。另外，扶埡東等[25]研究發(fā)現(xiàn)，生大黃的結(jié)合型蒽醌及縮合鞣質(zhì)均可引起瀉下作用。豬膽粉為豬膽汁的干燥品，性微寒，能清熱潤(rùn)燥而通熱秘。豬膽汁入藥首見于《傷寒論》，仲景有云：“和少許法醋，以灌谷道內(nèi)，如一食頃，當(dāng)大便出宿食惡物甚效。”[26]現(xiàn)代研究證實(shí)，豬膽汁能作用于M膽堿與α腎上腺素受體，促進(jìn)腸縱肌收縮，加強(qiáng)腸蠕動(dòng)。膽鹽類成分能抑制結(jié)腸吸收鹽分和水分，刺激副交感神經(jīng)，增加結(jié)腸積液。膽汁酸類成分口服能刺激膽汁分泌，促進(jìn)脂類吸收和膽固醇代謝，并產(chǎn)生輕瀉作用[27-29]。以上諸多研究進(jìn)一步驗(yàn)證了筆者的網(wǎng)絡(luò)藥理分析結(jié)果，即膽黃潤(rùn)腸丸治療STC的主要活性成分為原花青素B-5,3'-O-沒食子酸酯、番瀉甙D、大黃素甲醚雙葡萄糖甙和豬膽酸。

筆者構(gòu)建“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)PPI 時(shí)發(fā)現(xiàn)，ALB、EGFR、CASP3、ESR1、HSP90AA1 等為PPI 核心靶點(diǎn)。ALB 是血清白蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)，便秘癥狀緩解患者的ALB水平顯著提高，與患者營(yíng)養(yǎng)狀況改善有關(guān)[30]。EGFR 是表皮生長(zhǎng)因子受體，有研究[31]證實(shí)，缺乏EGFR 信號(hào)傳導(dǎo)標(biāo)志物的小鼠有排泄增加的現(xiàn)象，并有機(jī)構(gòu)由此研發(fā)治療便秘的藥物。CASP3 是參與細(xì)胞凋亡的半胱天冬酶，臨床研究[32]表明，與慢傳輸便秘等消化道疾病有關(guān)的“rhEGC 表型”會(huì)導(dǎo)致CASP3 的信使RNA 轉(zhuǎn)錄發(fā)生一定程度上調(diào)，提示CASP3 可能通過(guò)影響腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（EGC）來(lái)調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力。ESR1是雌激素受體α（ERα）基因，定位于腸神經(jīng)節(jié)和平滑肌細(xì)胞，是介導(dǎo)腸道運(yùn)動(dòng)的成分，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[33]發(fā)現(xiàn)，腸道發(fā)育過(guò)程中ERα 表達(dá)增加。HSP90AA1是熱休克蛋白，Li Pengpeng等[34]發(fā)現(xiàn)，表達(dá)HSP90AA1 的大腸桿菌細(xì)胞表現(xiàn)出更好的膜完整性，推測(cè)該蛋白對(duì)維護(hù)腸道菌群平衡和腸道正常功能起到一定輔助作用。GO富集結(jié)果涉及類固醇激素的反應(yīng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、囊泡腔、膜筏、蛋白激酶結(jié)合、蛋白域特異性結(jié)合等，與PPI核心靶點(diǎn)作用基本一致。

由KEGG 富集結(jié)果可見，膽黃潤(rùn)腸丸治療STC 主要涉及癌癥、IL-17、雌激素等信號(hào)通路。Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC）是胃腸道慢波起搏細(xì)胞，平滑肌張力感受器，可傳導(dǎo)腸神經(jīng)與平滑肌間的神經(jīng)信號(hào)。鄭宏群等[35]發(fā)現(xiàn)，腹腔注射TNF-α（腫瘤壞死因子α）的鼠小腸ICC 及細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)均有不同程度損傷，推測(cè)TNF-α 與ICC 線粒體損傷存在一定關(guān)聯(lián)性，也是導(dǎo)致消化道動(dòng)力障礙的誘因。IL-17 由T 輔助細(xì)胞Th17 產(chǎn)生，可直接或間接誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子、趨化因子、炎癥因子和抗微生物蛋白。曹蕾等[36]研究證實(shí)，IL-17A mRNA和蛋白在功能性便秘患者的結(jié)腸黏膜中具有高表達(dá)，說(shuō)明IL-17A參與了功能性便秘的發(fā)病或病理過(guò)程。李敏等[37]發(fā)現(xiàn)，術(shù)后腸梗阻的小鼠出現(xiàn)菌群失調(diào)、炎癥反應(yīng)、胃腸動(dòng)力障礙一系列癥狀，血清IL-17等炎癥細(xì)胞因子水平顯著升高，推測(cè)小鼠因腸道5-HT 和HIS釋放異常，5-HT無(wú)法與受體結(jié)合，從而導(dǎo)致胃腸道平滑肌張力減弱。一方面，雌激素可使NO 合成酶（NOS）的mRNA 高表達(dá)，通過(guò)合成NO、升高cGMP 來(lái)抑制結(jié)腸運(yùn)動(dòng)。另一方面，腸內(nèi)雌激素受體ERβ阻斷后c-kit mRNA 表達(dá)降低，影響ICC 的正常生理功能，也會(huì)造成胃腸道動(dòng)力不足[38]。此外，雌激素可阻滯H+-K+-ATP 酶，作用于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，抑制胃酸分泌，導(dǎo)致功能性消化不良。同時(shí)，雌激素阻止胰腺腺泡蛋白酶和淀粉酶的分泌，在胃排空延遲、缺少足夠食物、胃酸刺激的情況下，膽囊收縮素釋放減少，胰酶和膽汁的分泌減少均會(huì)對(duì)胃腸道運(yùn)化功能造成一定影響[39]。

綜上，筆者運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探究了膽黃潤(rùn)腸丸治療STC 的主要活性成分、核心靶點(diǎn)以及作用機(jī)制，為今后開展相關(guān)臨床研究提供參考。該研究還比較局限，如：膽黃潤(rùn)腸丸由大黃和豬膽粉經(jīng)混合粉碎泛制而成，而飲片粉碎和噴灑黏合劑（水或乙醇）的過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生一些新的化合物，這些化合物的生物活性和作用機(jī)理還是個(gè)未知數(shù)，有待進(jìn)一步研究和探討。