甘肅省部分中小規(guī)模豬場(chǎng)豬乙型腦炎流行現(xiàn)狀調(diào)查

姚奕蕾，宋建國(guó)，康文彪，周 峰，豆 玲，高軍軍，潘永紅

(甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730046)

豬乙型腦炎也稱豬日本腦炎(Japanese encephalitis，JE)是自然疫源性傳染病，豬是主要的儲(chǔ)存宿主和擴(kuò)增宿主，日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)對(duì)豬致死率不高，但會(huì)引起母豬繁殖障礙，導(dǎo)致懷孕母豬流產(chǎn)、死胎或產(chǎn)木乃伊胎，引起公豬睪丸急性炎癥反應(yīng)或不育[1]。在溫帶地區(qū)，豬乙型腦炎具有典型的季節(jié)性，通常始于4月份或5月份，并可持續(xù)到9月份或10月份[2]。1988年甘肅省秦安縣發(fā)現(xiàn)豬乙型腦炎[3]，2010年甘肅省10個(gè)市州豬群的JEV抗體陽(yáng)性率達(dá)到73.3%[4]，以后未見(jiàn)有關(guān)JEV感染的報(bào)道。相比較而言，由于乙型腦炎的危害小于豬瘟(CSF)、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)和偽狂犬病(PR)等疫病，因此，甘肅省以往對(duì)該病的調(diào)查研究?jī)H限于感染抗體檢測(cè)，缺乏病原學(xué)檢測(cè)和混合感染調(diào)查。2014年，我們申報(bào)了甘肅省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目，將豬乙型腦炎納入豬垂直傳播疫病之一，從感染抗體、病毒核酸和混合感染三個(gè)方面對(duì)規(guī)模豬場(chǎng)豬乙型腦炎的感染現(xiàn)狀開(kāi)展了較為系統(tǒng)的調(diào)查，其目的是查明甘肅省中小型規(guī)模豬場(chǎng)豬乙型腦炎的流行現(xiàn)狀，為該病的臨床防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 在蘭州市和武威市選取10個(gè)均未對(duì)JE免疫的(榆中縣4個(gè)、涼州區(qū)6個(gè))中小型豬場(chǎng)采集531份血清和春季、秋季分別采集的481份和511份腦組織樣品，其中種公豬29份、生產(chǎn)母豬30份、后備母豬269份、空懷母豬224份、哺乳仔豬90份、保育豬253份、育成豬67份、育肥豬561份，進(jìn)行JEV抗體和病毒核酸檢測(cè)。

1.1.2 試劑和儀器 豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒,武漢科前生物股份有限公司產(chǎn)品；日本腦炎病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型RT-PCR檢測(cè)試劑盒、豬偽狂犬病病毒PCR檢測(cè)試劑盒、豬細(xì)小病毒PCR檢測(cè)試劑盒、豬圓環(huán)病毒PCR檢測(cè)試劑盒，北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司產(chǎn)品；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)博騰公司產(chǎn)品；普通PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，UVITEE公司產(chǎn)品；水平電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 JEV抗體檢測(cè) 采用間接ELISA方法檢測(cè)，將采集到的531份豬血清按說(shuō)明書(shū)要求用稀釋液稀釋好后，加入到包被好滅活病毒的包被板上，37℃溫育30 min，洗滌5次后加入酶標(biāo)二抗37℃溫育30 min，洗滌5次后加入底物液避光顯色10 min，加入終止液。最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)在630 nm處的吸光度值，讀取結(jié)果。

1.2.2 JEV核酸檢測(cè) 按《流行性乙型腦炎診斷技術(shù)》(GB/T 18638-2021)7.1至7.5中規(guī)定的普通RT-PCR的檢驗(yàn)操作方法進(jìn)行檢測(cè)。將春季采集的481份和秋季采集的531份豬腦組織樣品，取1.5 g左右放入無(wú)菌研磨棒中研碎后，加入pH7.4的PBS制成懸液，離心后取上清液進(jìn)行病毒RNA的提取，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)使用柱式法提取病毒RNA，將提取好的模板加入反應(yīng)體系中，按照50℃ 30 min；94℃ 5 min；94℃ 40 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s 30次循環(huán),進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察結(jié)果。

1.2.3 其他病毒核酸檢測(cè) PRRSV按《豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法》(GB/T 18090-2008)中9反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的規(guī)定進(jìn)行；PRV按《偽狂犬病診斷方法》(GB/T 18641-2018)中7聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的規(guī)定進(jìn)行；PCV2按《豬圓環(huán)病毒聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法》(GB/T 21674-2008)中的規(guī)定進(jìn)行；PPV按《豬細(xì)小病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 1919-2016)中7.5的規(guī)定進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 JEV抗體檢測(cè)

10個(gè)豬場(chǎng)均檢測(cè)到了抗體陽(yáng)性豬只，場(chǎng)陽(yáng)性率為100%；共檢測(cè)血清樣品531份，陽(yáng)性418份，抗體個(gè)體陽(yáng)性率為78.72%，10個(gè)場(chǎng)7個(gè)不同種類豬群全部檢測(cè)出陽(yáng)性樣品，其中1個(gè)場(chǎng)的生產(chǎn)母豬個(gè)體陽(yáng)性率為100%，2個(gè)場(chǎng)種公豬的個(gè)體陽(yáng)性率為60.00%(表1)。

2.2 JEV核酸檢測(cè)

春季檢測(cè)來(lái)自10個(gè)場(chǎng)戶的481份樣品，從4個(gè)場(chǎng)的育肥豬和空懷母豬群體內(nèi)檢出陽(yáng)性26份，場(chǎng)陽(yáng)性率為40%，個(gè)體陽(yáng)性率為5.41%；秋季檢測(cè)10個(gè)場(chǎng)的511份樣品，從5個(gè)場(chǎng)的后備母豬、空懷母豬、育成豬和育肥豬群體內(nèi)檢出檢出陽(yáng)性32份，場(chǎng)陽(yáng)性率為50%，個(gè)體陽(yáng)性率為6.26%(表2)。

表1中小規(guī)模場(chǎng)JEV抗體檢測(cè)結(jié)果

表2中小型豬場(chǎng)JEV核酸檢測(cè)結(jié)果

2.3 混合感染情況

甘肅省中小規(guī)模場(chǎng)對(duì)豬乙型腦炎不開(kāi)展免疫，各生長(zhǎng)階段豬群的感染抗體均呈陽(yáng)性；后備母豬、空懷母豬和育肥豬3個(gè)群體均存在JEV感染；對(duì)JE抗體檢測(cè)陽(yáng)性的豬只進(jìn)行PRV、PRRSV和PPV的病毒核酸RT-PCR和PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)發(fā)生混合感染率為30%。春季在3個(gè)場(chǎng)內(nèi)檢測(cè)到空懷母豬和育肥豬群體存在JEV與PRV、和PPV等3種病原的混合感染。其中2個(gè)場(chǎng)內(nèi)空懷母豬和育肥豬同時(shí)發(fā)生混合感染；秋季在3個(gè)場(chǎng)內(nèi)檢測(cè)到空懷母豬、后備母豬和育肥豬群體發(fā)生JEV與PRRSV、PRV、和PPV等4種病原的混合感染。有2個(gè)場(chǎng)存在空懷母豬和育肥豬，后備母豬和育肥豬同時(shí)發(fā)生感染，混合感染有2～5種病原的二重、三重、四重和五重共10種方式(表3)。

表3中小型豬場(chǎng)其他病毒與JEV混合感染情況

3 討論

本次抗體檢測(cè)和病毒核酸檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，JEV場(chǎng)陽(yáng)性率和個(gè)體陽(yáng)性率都比較高。2000年甘肅省規(guī)?；i場(chǎng)豬群豬乙型腦炎抗體的個(gè)體陽(yáng)性率為15.56%[12]，2010年為73.3%[4]，本次調(diào)查結(jié)果為78.72%。JEV核酸檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其場(chǎng)陽(yáng)性率和個(gè)體陽(yáng)性率分別高達(dá)50%和6.26%。可見(jiàn)甘肅省規(guī)?；i場(chǎng)的豬乙型腦炎感染有不斷加重的趨勢(shì)。究其原因：一是動(dòng)物防疫機(jī)構(gòu)和養(yǎng)豬場(chǎng)對(duì)豬乙型腦炎防控工作的重視程度不夠，免疫接種不到位；二是豬的頻繁調(diào)運(yùn)，尤其是從南方地區(qū)調(diào)豬起到了推波助瀾的作用；三是養(yǎng)殖場(chǎng)防蚊滅鼠、無(wú)菌操作等不扎實(shí)不規(guī)范。

乙型腦炎是重要的人畜共患病，豬是人乙型腦炎最重要的傳染源，事實(shí)上甘肅省天水、隴南等地每年都有人乙型腦炎發(fā)生，因而嚴(yán)格有效防控豬乙型腦炎勢(shì)在必行。建議養(yǎng)豬場(chǎng)和各級(jí)動(dòng)物防疫機(jī)構(gòu)重視豬乙型腦炎的防控，做好種豬乙型腦炎的程序化免疫工作和檢疫檢測(cè)、調(diào)運(yùn)監(jiān)管工作。及時(shí)開(kāi)展動(dòng)物疫病風(fēng)險(xiǎn)分析，提高生物安全水平，降低傳染病發(fā)生和傳播的風(fēng)險(xiǎn)。養(yǎng)豬場(chǎng)還應(yīng)做好防蟲(chóng)滅鼠工作，減少傳播媒介和易感動(dòng)物。規(guī)范防疫和生產(chǎn)操作，特別是剪牙、斷尾、注射等無(wú)菌操作。

此外本次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)中小規(guī)模場(chǎng)豬群存在多種病毒的混合感染，如豬圓環(huán)病毒2型和豬乙型腦炎毒的混合感染，豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬乙型腦炎病毒的混合感染，豬細(xì)小病毒和豬乙型腦炎病毒的混合感染，偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒和豬乙型腦炎病毒的混合感染，豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病病毒和豬乙型腦炎病毒的混合感染，豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒和豬乙型腦炎病毒等多種復(fù)雜的混合感染。因而養(yǎng)豬場(chǎng)要貫徹預(yù)防為主，預(yù)防與控制、凈化和消滅相結(jié)合的動(dòng)物防疫方針，重視各類疫病的綜合防控，尤其要重視垂直傳播疫病的防控，逐漸凈化垂直傳播疫病。