規(guī)?；i場(chǎng)豬繁殖與呼吸綜合征的診斷與防控

賈 佩，連 星，張 琪，郭抗抗，許信剛，周宏超*

(1.陜西正能農(nóng)牧科技有限責(zé)任公司，陜西高陵 7102011；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

中國(guó)是生豬產(chǎn)業(yè)大國(guó)，生豬飼養(yǎng)量占世界生豬飼養(yǎng)量的50%。2018年國(guó)內(nèi)突然暴發(fā)的非洲豬瘟(African swine fever，ASF)疫情使得我國(guó)生豬的養(yǎng)殖、屠宰、經(jīng)營(yíng)和運(yùn)輸情況都發(fā)生了較大的改變。聯(lián)防聯(lián)控等相關(guān)措施限制了異地豬源的調(diào)動(dòng)，導(dǎo)致區(qū)域內(nèi)種豬場(chǎng)引種種源質(zhì)量差的問題，若未經(jīng)嚴(yán)格檢測(cè)篩選，引種易引發(fā)豬群疫病的發(fā)生。

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種重要豬傳染病，其特征是妊娠母豬的繁殖障礙，包括妊娠后期母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎和弱仔，以及生長(zhǎng)豬的呼吸道疾病，如間質(zhì)性肺炎等[1-2]。該病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[3]。自1996年郭清寶[4]分離出我國(guó)的第1株豬繁殖與呼吸綜合征病毒毒株后，隨后的20多年中，PRRSV一直廣泛傳播并不斷變異[5]，2006年出現(xiàn)了能夠使感染豬表現(xiàn)高發(fā)病率、高病死率、高體溫的“三高”癥狀的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒[6]，即HP-PRRSV。從2012年開始中國(guó)多個(gè)省份報(bào)道了多株NADC30 PRRSV毒株，且與經(jīng)典PRRSV、HP-PRRSV等不同類型毒株發(fā)生重組[7-9]。到2016年，此類毒株已蔓延至我國(guó)大部分省份，是導(dǎo)致我國(guó)目前PRRS流行的主要原因之一[10-11]。由于PRRSV 類NADC30毒株間存在廣泛的重組，不僅導(dǎo)致病毒毒力發(fā)生變化，而且PRRS商品疫苗無(wú)法提供完全保護(hù)[12-13]，可見僅依靠疫苗免疫對(duì)PRRSV 類NADC30的田間防控是不夠的。本文對(duì)陜西省某規(guī)模化豬場(chǎng)發(fā)生的繁殖障礙母豬群進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷，確診為PRRSV類NADC30引起的豬群波動(dòng)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果制定綜合防控方案，并對(duì)該防控方案的有效性進(jìn)行追蹤評(píng)價(jià)，以期為陜西地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)后期有效防控此類疾病提供臨床經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)支持。

1 基本情況

1.1 豬群發(fā)病情況

陜西省咸陽(yáng)市某規(guī)?；i場(chǎng)存欄基礎(chǔ)母豬4 800頭，2020年11月10日引種后備母豬200頭，后備豬入場(chǎng)2周后后備豬群出現(xiàn)大規(guī)?？人?、呼吸困難、皮膚發(fā)紅、采食量下降、急性死亡，2020年12月23日妊娠母豬群出現(xiàn)發(fā)熱、流產(chǎn)，流產(chǎn)胎兒皮膚發(fā)紅、耳尖發(fā)紫、臍帶腫脹、剖檢可見肺臟水腫、間質(zhì)性肺炎、淋巴結(jié)腫大發(fā)青，分娩母豬產(chǎn)死胎、木乃伊、弱仔(0.7 kg以下)的比例增加，高達(dá)20.5%。仔豬斷奶1周后出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽，呼吸道癥狀明顯，瘦弱，死亡率增加。

1.2 診斷及評(píng)估檢測(cè)

1.2.1 儀器 -25℃冰箱(YCD-265)，澳柯瑪股份有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)(D3024)，大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；離心管架、加樣槽、電熱恒溫箱(DHP-2)，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；移液器(F3)、酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀，北京愛德士元亨生物科技有限公司產(chǎn)品；核酸提取儀，上海醫(yī)脈賽科技有限公司產(chǎn)品。

1.2.2 試劑 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒和豬繁殖與呼吸綜合征qPCR檢測(cè)試劑盒，北京愛德士元亨生物科技有限公司產(chǎn)品；醫(yī)脈賽磁珠法核酸提取試劑，上海醫(yī)脈賽科技有限公司產(chǎn)品。所有樣品的檢測(cè)試劑為同批次試劑盒，試劑均在規(guī)定有效期內(nèi)使用，豬繁殖與呼吸綜合征抗體試劑盒4℃保存?zhèn)溆?，核酸提取試劑常溫保存?zhèn)溆?，豬繁殖與呼吸綜合征病原擴(kuò)增試劑盒-25℃冷凍保存。

1.2.3 方法

1.2.3.1 病原檢測(cè)方法 核酸提取參照醫(yī)脈賽磁珠法病毒RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行病毒核酸的提取。從試劑盒中取出預(yù)分裝96深孔板，顛倒混勻(目的是重懸磁珠)，撕去鋁箔封口膜，在樣本提取孔加入200 μL樣本和20 μL蛋白酶K，放置于核酸提取儀中，選擇RNA提取程序運(yùn)行，運(yùn)行結(jié)束后收集核酸。目標(biāo)病原擴(kuò)增參照愛德士藍(lán)耳豬繁殖與呼吸綜合征qPCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行病原擴(kuò)增，取50 μL的PCR反應(yīng)管，每個(gè)反應(yīng)管添加10 μL PRRS檢測(cè)預(yù)混液，添加10 μL RNA擴(kuò)增預(yù)混液，微量振蕩器震振混勻后添加5 μL樣品提取核酸，將配好體系的反應(yīng)管至于PCR儀中，選擇擴(kuò)增程序(50℃ 15 min；95℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，45個(gè)循環(huán))，程序運(yùn)行結(jié)束后分析結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：在試驗(yàn)成立的情況下(陽(yáng)性對(duì)照FAM通道有標(biāo)準(zhǔn)型“S”型曲線且Ct值<38、陰性對(duì)照FAM無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線且無(wú)Ct值)，若樣本對(duì)應(yīng)的FAM通道有標(biāo)準(zhǔn)“S”型擴(kuò)增曲線且Ct值<38則為陽(yáng)性，若樣本對(duì)應(yīng)的FAM通道無(wú)標(biāo)準(zhǔn)“S”型擴(kuò)增曲線且無(wú)Ct值則為陰性。對(duì)于試驗(yàn)不成立的實(shí)驗(yàn)樣本需重新進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.3.2 抗體檢測(cè)方法 參照愛德士豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，操作程序?yàn)椋簶悠废♂?40倍稀釋)-孵育(30 min)-洗板-酶標(biāo)抗體孵育(30 min)-洗板-顯色(15 min)-終止-讀數(shù)；試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算及判斷標(biāo)準(zhǔn)：在650 nm處讀取陰陽(yáng)性對(duì)照和每個(gè)樣品的OD值，在試驗(yàn)成立的情況下(陽(yáng)性對(duì)照OD值-陰性對(duì)照OD值≥0.15且陰性對(duì)照OD值≤0.15)，計(jì)算每個(gè)樣本的S/P值，若S/P值<0.4為陰性，若S/P值≥0.4為陽(yáng)性。對(duì)于試驗(yàn)不成立的樣本需重新進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 檢測(cè)結(jié)果

1.3.1 病原檢測(cè)結(jié)果 對(duì)于采集的后備舍咳嗽豬只的口鼻拭子(1～4號(hào)樣本)、分娩舍流產(chǎn)母豬的口鼻拭子(5～8號(hào)樣本)、母豬流產(chǎn)分泌物(9～12號(hào)樣本)及流產(chǎn)胎兒的肺臟、脾臟和淋巴結(jié)(13～16號(hào)樣本)等組織進(jìn)行PRRSV病原的qPCR試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)成立(陽(yáng)性對(duì)照具有標(biāo)準(zhǔn)“S”型擴(kuò)增曲線且Ct值=28.47、陰性對(duì)照FAM通道無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線且無(wú)Ct值)，1～16號(hào)樣本檢測(cè)結(jié)果均為藍(lán)耳病病原陽(yáng)性(1～16號(hào)樣本對(duì)應(yīng)的FAM通道有標(biāo)準(zhǔn)“S”型擴(kuò)增曲線且Ct值<38)(圖1)。

數(shù)字為樣本號(hào)；P.陽(yáng)性對(duì)照；N.陰性對(duì)照。Digts are sample numbers; P.Positive control; N.Negative control

1.3.2 抗體檢測(cè) 對(duì)于引種前隨機(jī)采集的后備舍母豬30份血清、引種1個(gè)月后隨機(jī)采集的后備舍母豬30份血清、引種前隨機(jī)采集的妊娠舍妊娠母豬30份血清、引種1個(gè)月后隨機(jī)采集的妊娠舍妊娠母豬30份血清進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征的抗體檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，后備舍引種前豬群的抗體S/P均值為1.25、離散度為30.5%、陽(yáng)性率為100%，其中S/P<0.4占比0%、0.4≤S/P<0.8占比13.3%、0.8≤S/P<1.6占比63.3%、1.6≤S/P<2.0占比23.3%、2.0≤S/P<2.5占比0%、S/P>2.5占比0%；后備舍引種后豬群的抗體S/P均值為1.64離散度為34.7%、陽(yáng)性率為96.7%，其中S/P<0.4占比3.3%、0.4≤S/P<0.8占比10%、0.8≤S/P<1.6占比26.73%、1.6≤S/P<2.0占比26.7%、2.0≤S/P<2.5占比30%、S/P>2.5占比3.3%；妊娠舍引種前豬群的抗體S/P均值為1.41、離散度為26.5%、陽(yáng)性率為100%，其中S/P<0.4占比0%、0.4≤S/P<0.8占比6.7%、0.8≤S/P<1.6占比66.7%、1.6≤S/P<2.0占比23.3%、2.0≤S/P<2.5占比.3.3%、S/P>2.5占比0%；妊娠舍引種后豬群的抗體S/P均值為1.83、離散度為45%、陽(yáng)性率為90%，其中S/P<0.4占比10%、0.4≤S/P<0.8占比3.3%、0.8≤S/P<1.6占比23.3%、1.6≤S/P<2.0占比13.3%、2.0≤S/P<2.5占比26.7%、S/P>2.5占比23.3%(圖2和圖3)。

A.引種前后備豬群PRRS抗體檢測(cè)結(jié)果S/P值數(shù)據(jù)分布圖；B.引種一個(gè)月后后備豬群PRRS抗體檢測(cè)結(jié)果S/P值數(shù)據(jù)分布圖。

1.3.3 PRRSV陽(yáng)性樣本ORF5基因測(cè)序 將該豬場(chǎng)PRRSV陽(yáng)性樣本測(cè)序序列毒株命名為212442-1，測(cè)序的PRRSV ORF5的基因序列和國(guó)內(nèi)外代表毒株序列用生物信息學(xué)軟件DNASTAR和MEGA7進(jìn)行同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。同源性比對(duì)結(jié)果表明，該毒株ORF5基因與NADC30和類NADC30的基因相似性最高，為93.4%和91.2%，與疫苗株CH-1a，VR-2332及TJ基因相似性較低，分別為86.2%、85.7%、84.4%，進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，212442-1處在NADC30和類NADC30的分支上(圖4和圖5)。

C.引種前妊娠豬群PRRS抗體檢測(cè)結(jié)果S/P值數(shù)據(jù)分布圖；D.引種一個(gè)月后妊娠豬群PRRS抗體檢測(cè)結(jié)果S/P值數(shù)據(jù)分布圖。

1.4 診斷結(jié)果

根據(jù)豬群臨床表現(xiàn)，發(fā)病豬臨床癥狀，死亡豬只的剖檢變化及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果分析，該病例診斷為PRRSV引起的豬群異常波動(dòng)。

2 防控方案

2.1 生產(chǎn)防控措施

場(chǎng)內(nèi)豬群緊急封群，半年內(nèi)不做引種計(jì)劃。豬群嚴(yán)格按照批次化管理，實(shí)現(xiàn)全進(jìn)全出。加強(qiáng)豬場(chǎng)內(nèi)外部生物安全管理，門口設(shè)消毒洗手盆和腳踏盆，生產(chǎn)人員洗澡換衣后方可進(jìn)舍。用0.3%過(guò)氧乙酸帶豬消毒，1周1次。產(chǎn)房仔豬剪牙、斷尾、補(bǔ)鐵及免疫等用具消毒劑浸泡處理，一窩一套。弱仔直接淘汰，21 d斷奶仔豬全部轉(zhuǎn)離母豬場(chǎng)。

2.2 藥物治療方案

2020年12月25日用20%替米考星+20%多西環(huán)素+電解多維(2 kg/t)給豬群保健7 d，用200 mg/L卡巴匹林鈣給發(fā)燒豬只保健3 d。

2.3 疫苗免疫方案

2021年1月5日，后備豬群全群緊急免疫PRRS VR2332毒株弱毒活疫苗1頭份/頭，2021年1月29日后備豬全群免疫PRRS VR2332毒株弱毒活疫苗1頭份/頭；妊娠母豬產(chǎn)前40 d免疫PRRS滅活疫苗(浙江美保龍)1頭份/頭；仔豬14日齡免疫PRRSV VR2332毒株弱毒活疫苗1頭份。

圖4基于ORF5基因的進(jìn)化樹

圖5 GP5核苷酸序列比對(duì)結(jié)果

3 防控效果

3.1 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)評(píng)估

3.1.1 PRRSV病原評(píng)估

3.1.1.1 后備舍水平傳播評(píng)估 在方案實(shí)施前后，對(duì)比后備舍的固定欄位環(huán)境樣本的PRRSV檢出情況(表1)，以此來(lái)評(píng)估后備舍PRRSV水平傳播情況。檢測(cè)結(jié)果顯示，綜合防控方案實(shí)施前A1欄、A7欄、A13欄、A20欄、B4欄、B6欄、B10欄、B16欄、圈舍環(huán)境及生產(chǎn)工具的樣本檢測(cè)qPCR檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性；綜合防控方案實(shí)施4個(gè)月后A1欄、A7欄、A13欄、A20欄、B4欄、B6欄、B10欄、B16欄、圈舍環(huán)境及生產(chǎn)工具的樣本檢測(cè)qPCR檢測(cè)結(jié)果除圈舍環(huán)境為陽(yáng)性(Ct=37.66)外，其余樣本均為陰性。可見，經(jīng)過(guò)為期4個(gè)月的綜合防控方案的實(shí)施，后備舍的環(huán)境中病毒載量明顯降低，間接表明豬群健康狀況逐漸好轉(zhuǎn)。

3.1.1.2 分娩舍垂直傳播評(píng)估 在方案實(shí)施前后，對(duì)比分娩舍的仔豬臍帶血的PRRSV檢出情況(表2)，以此評(píng)估分娩舍PRRSV垂直傳播情況。檢測(cè)結(jié)果顯示，綜合防控方案實(shí)施前隨機(jī)采集分娩舍30份臍帶血樣本PRRSV qPCR檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性(PRRSV陽(yáng)性檢出率100%)；綜合防控方案實(shí)施4個(gè)月后隨機(jī)采集分娩舍30份臍帶血樣本PRRSV qPCR檢測(cè)結(jié)果除1～5號(hào)樣本為陽(yáng)性(Ct=37.99)外(陽(yáng)性檢出率為20%)，其余樣本均為陰性?？梢娊?jīng)過(guò)為期4個(gè)月的綜合防控方案的實(shí)施，分娩母豬的垂直傳播率明顯降低，間接表明豬群健康狀況逐漸好轉(zhuǎn)。

3.1.2 豬群PRRSV抗體評(píng)估 在方案實(shí)施前后，對(duì)比后備舍和妊娠母豬的PRRSV抗體變化，以此評(píng)估豬群的健康狀況。檢測(cè)結(jié)果顯示，綜合防控方案實(shí)施前后備母豬和妊娠母豬的PRRSV抗體平均值、離散度、陽(yáng)性率及S/P>2.5的比例分別為：1.55、51.6%、100%、31%和1.34、46.7%、100%、25%；綜合防控方案實(shí)施4個(gè)月后后備母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬的PRRSV抗體平均值、離散度、陽(yáng)性率及S/P>2.5的比例分別為1.1、41%、100%、0%和1.2、43.1%、100%、0%(表3)?？梢娊?jīng)過(guò)為期4個(gè)月的綜合防控方案的實(shí)施，后備母豬和妊娠母豬的平均值和離散度均有不同程度的降低，S/P>2.5的比例明顯降低。

表1 PRRSV水平傳播評(píng)估結(jié)果(qPCR ct值)

表2 PRRSV垂直傳播評(píng)估結(jié)果(qPCR ct值)

3.2 豬群生產(chǎn)成績(jī)

根據(jù)豬場(chǎng)每月生產(chǎn)報(bào)表，統(tǒng)計(jì)發(fā)病時(shí)2個(gè)月和PRRS防控方案實(shí)施后4個(gè)月的窩均產(chǎn)仔數(shù)、窩均健子數(shù)及分娩舍死亡率，以此對(duì)比結(jié)果評(píng)估PRRS防控方案的有效性。生產(chǎn)成績(jī)跟蹤結(jié)果表明，發(fā)病時(shí)和防控方案實(shí)施4個(gè)月后，窩均產(chǎn)仔數(shù)均為12～13；發(fā)病時(shí)，窩均健子數(shù)從原來(lái)的10.16下降到8.91，綜合防控方案實(shí)施4個(gè)月后，窩均健子數(shù)恢復(fù)到9.33；發(fā)病時(shí)，產(chǎn)房死亡率從7.5%上升至21.1%，防控方案實(shí)施4個(gè)月時(shí)，產(chǎn)房死亡率下降至11.3%(表4)。

表3 PRRSV抗體檢測(cè)結(jié)果

表4豬場(chǎng)生產(chǎn)成績(jī)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3.3 防控成效

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)評(píng)估和豬群生產(chǎn)成績(jī)?cè)u(píng)估的雙向評(píng)估，該綜合防控方案對(duì)PRRSV NADC30引起的豬場(chǎng)流產(chǎn)風(fēng)暴有效。

4 討論

自2012年我國(guó)首次報(bào)道PRRSV NADC30以來(lái)，許多PRRSV NADC30株與國(guó)內(nèi)HP-PRRSV、VR-2332之間的重組毒株相繼被發(fā)現(xiàn)，包括HENAN-HEB、JL580、HNjz15、HNhx、TJnh1501、FJ1402、Chsx1401和HNyc15等[14-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)中部地區(qū)HP-PRRS似乎逐漸消失，取而代之的為類NADC 30毒株[18]，類NADC30是由NADC30變異而來(lái)，兩者位于同一個(gè)進(jìn)化分支。

臨床隨意更換不同毒株的弱毒苗，加之病毒間的重組變異的發(fā)生，致使田間出現(xiàn)多種不同毒株的混合感染，豬繁殖與呼吸綜合征防控僅靠疫苗免疫達(dá)不到滿意效果[19]。張洪亮等[20]通過(guò)攻毒試驗(yàn)評(píng)價(jià)HP-PRRS活疫苗對(duì)類NADC30的免疫保護(hù)，結(jié)果表明，HP-PRRSV活疫苗(HuN4-F112株)對(duì)類NADC30 PRRSV SD53-1603株可用提供較好的臨床保護(hù)，但不能提供完全保護(hù)。段振華等[21]曾通過(guò)滅活苗和藥物保健的方法成功控制了豬場(chǎng)類NADC30 引發(fā)的豬場(chǎng)大規(guī)模流產(chǎn)。馬堅(jiān)[22]比較了弱毒苗和滅活苗對(duì)類NADC30的防控效果，結(jié)果顯示，弱毒苗免疫組、滅活苗免疫組和聯(lián)合免疫組對(duì)類NADC30都有一定的防控效果，其中弱毒疫苗和滅活疫苗的聯(lián)合免疫組效果最為顯著。周磊等[23]評(píng)估了3種商用疫苗對(duì)類NADC30毒株的保護(hù)效果，發(fā)現(xiàn)疫苗免疫能縮短攻毒豬的發(fā)熱時(shí)間、弱化臨床癥狀、提高日增重。楊漢春[24]指出，目前沒有可抵抗類NADC30毒株感染的商用疫苗，但疫苗免疫可提供一定的交叉保護(hù)。

本研究與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，通過(guò)生產(chǎn)防控措施、藥物保健、生物安全管控及疫苗免疫等綜合防控措施，經(jīng)過(guò)4個(gè)月的生產(chǎn)數(shù)據(jù)跟蹤及檢測(cè)評(píng)估，后備舍的水平傳播和分娩舍的垂直傳播情況均有好轉(zhuǎn)，后備豬群和經(jīng)產(chǎn)母豬群類NADC30病毒排毒情況均有降低，生產(chǎn)成績(jī)也有相應(yīng)的提高，PRRS防控是一個(gè)復(fù)雜而系統(tǒng)的工作，豬群應(yīng)對(duì)藍(lán)耳病類NADC30毒株應(yīng)采取綜合手段，而且應(yīng)長(zhǎng)期嚴(yán)格執(zhí)行[25]，該豬場(chǎng)從PRRS活躍場(chǎng)轉(zhuǎn)為PRRS陽(yáng)性穩(wěn)定場(chǎng)還需要更長(zhǎng)的時(shí)間。

從目前商用疫苗的效果來(lái)看，疫苗免疫不能有效阻斷PRRSV的傳播和發(fā)生，且疫苗本身也存在一定的安全問題[26]。在豬場(chǎng)生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)加強(qiáng)生物安全管控、強(qiáng)化生產(chǎn)管理、謹(jǐn)慎引種、合理選擇疫苗、使用PRRSV陰性精液、定期監(jiān)測(cè)場(chǎng)內(nèi)PRRS的活躍情況、通過(guò)監(jiān)測(cè)剔除長(zhǎng)期排毒豬只、高風(fēng)險(xiǎn)期閉群，以此綜合防控措施來(lái)逐步實(shí)現(xiàn)PRRS的穩(wěn)定控制或者凈化。