云南玉溪部分地區(qū)鴿子血變原蟲分子鑒定及進化分析

董仙蘭，萬寶云，李紅霞，杜娟娟，楊秋楠，徐 聰*

(云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，云南昆明 650201；2.云南省玉溪市易門縣農(nóng)業(yè)局，云南玉溪 651100；3.云南省玉溪市動物疫病預防控制中心，云南玉溪 653100)

血變原蟲屬(Haemoproteus)主要寄生在鳥類紅細胞內(nèi)，已在72個科的鳥類中發(fā)現(xiàn)超過140種鳥類血變原蟲[1-2]。在亞洲、歐洲、南美洲、北美洲和非洲的許多動物園都有相關報道[3-6]。國內(nèi)記載鳥類血變原蟲的文獻中,明確種類的僅有鴿血變原蟲[7]。1989年我國首次報道福建廈門家鴿感染鴿血變原蟲(Haemoproteuscolumbae)，并闡述了鴿血變原蟲(H.columbae)的生活史，證明虱蠅是其傳播媒介，主要流行于溫帶和熱帶地區(qū)[8]。血變原蟲對鳥類健康影響大。鴿感染后會導致鴿貧血、厭食、體重下降、精神沉郁、跛行、呼吸困難和突然死亡，又被稱為鴿瘧疾。感染的鴿子均處于慢性感染階段，影響家鴿健康[9]。宿主的身體狀況與感染強度呈負相關[10]。本研究旨在對鴿血變原蟲進行分子流行情況調(diào)查，為鴿血變原蟲的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 采集云南玉溪研和地區(qū)2個鴿子養(yǎng)殖場的血液樣品324份,用EDTA-2K抗凝管采集，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 血液DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Master Mix酶，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 恒溫水浴箱，深華生物技術有限公司產(chǎn)品；高速臺式離心機，Wise Spin公司產(chǎn)品；PCR儀，Bibby Scientific公司產(chǎn)品；水平電泳儀，BAYGENE公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，大韓科學儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 血變原蟲cytb基因擴增 根據(jù)文獻[11]中cytb基因特異套式PCR引物對所有樣品進行檢測，目的片段大小約為500 bp(表1)。

1.2.2 DNA提取與套式PCR檢測 參照血液DNA提取試劑盒說明書提取DNA，并進行套式PCR擴增。第1輪反應體系為：ddH2O 11 μL,2×TaqPCR Master Mix酶11 μL,引物各0.5 μL，模板2 μL，反應總體積為25 μL。反應條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s，25個循環(huán)；72℃延伸10 min。第2輪反應體系同第1輪，反應條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。同時設立陰、陽性對照。

1.2.3 測序分析 取4 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳約30 min后，于紫外分析儀中觀察，陽性條帶對應的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果用SeqMan5.01拼接，拼接序列提交至NCBI中獲得序列登錄號，并在Blast在線比對，下載GenBank中公布的鴿血變原蟲相關序列，用鄰接法(N-J)在MEGA6.0軟件中構建系統(tǒng)進化樹，確定蟲株種屬關系。

表1 cytb基因的引物序列

2 結果

2.1 電泳結果

324份血液樣品中檢出12份陽性，陽性率為3.70%(圖1),500 bp左右的條帶即為目的條帶。

M.DNA標準DL 2 000；1～8.樣品；-.陰性對照；+.陽性對照

2.2 序列比對結果

12份陽性樣品測序，將拼接結果在NCBI的Blast上進行比對分析，發(fā)現(xiàn)12份樣品中7份樣品序列與伊朗地區(qū)的鴿血變原蟲(H.columbae)相似性為98.67%～99.60%，5份與巴西地區(qū)的鴿血變原蟲(H.columbae)序列相似性達99.42%(表2)，同時測序結果用SeqMan5.01拼接，拼接序列提交至NCBI中獲得序列登錄號為MT576132-43。

2.3 進化分析結果

用MEGA6.0軟件N-J法構建基因進化樹，發(fā)現(xiàn)鴿子感染的血變原蟲的種類比較單一，都是鴿血變原蟲(H.columbae)(圖2)，圖2中▲表示試驗樣本。試驗樣品與血變原蟲置信度為100%，與鴿血變原蟲位于同一分支，表明玉溪地區(qū)鴿子感染了鴿血變原蟲。

表2樣本cytb基因序列在NCBI-BLAST中相似性比較結果

3 討論

規(guī)?；曫B(yǎng)肉鴿是我國近幾年來發(fā)展起來的一種養(yǎng)殖業(yè)，云南玉溪是養(yǎng)殖鴿子存欄量較多的地區(qū)，鴿存欄量大概在12萬只左右，養(yǎng)殖過程中，重點關注的寄生蟲病是毛滴蟲病[12]，血變原蟲病關注較少。直到云南玉溪的某養(yǎng)鴿場發(fā)生了鴿子死亡才引起重視。結合該病的傳播媒介虱蠅在該養(yǎng)殖場的流行情況，經(jīng)初步診斷，推測可能為血液原蟲病。據(jù)此，采集了鴿子血液樣本，對血變原蟲的cytb基因進行特異性套式PCR檢測，結果表明玉溪地區(qū)鴿感染的血變原蟲為鴿血變原蟲。樣品與血變原蟲以100%的置信度位于同一大分支，與已報道的博茨瓦特、巴西、哥倫比亞、美國、南非等國家的鴿血變原蟲位于同一分支，表明是同一種群。

本試驗采集的324份血液樣品中檢出12份陽性，陽性率為3.70%，鴿血變原蟲的感染率相對較低，可能與各地區(qū)間的氣候條件、虱蠅等中間宿主的流行情況及飼養(yǎng)管理差異有關。同時也可能與養(yǎng)殖場的選址及飼養(yǎng)管理較好有關，鴿血變原蟲病不僅會對養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失，該病的中間宿主虱蠅等也會對人類健康構成嚴重威脅。因此，加強玉溪乃至整個云南省鴿子飼養(yǎng)管理中血變原蟲及中間宿主虱蠅的防控十分重要。

圖2血變原蟲cytb基因進化樹(N-J)