酮病奶牛血液生化指標和肝臟病理變化分析

葉瑋琪，蔡金音，陳 曦，范欣怡，趙 倩，蘇亮飛，和鳳平，張立梅，江康峰，李小兵

(云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，云南昆明 650000)

隨著云南省奶牛業(yè)的迅速發(fā)展，奶牛疾病發(fā)生比例逐漸增多，尤其是奶牛酮病。奶牛酮病雖然病死率低，但導致奶牛生產性能下降，繼發(fā)其他疾病，使牧場飼養(yǎng)成本增加，影響?zhàn)B殖效益[1]。奶牛新陳代謝中85%的葡萄糖由肝臟合成，肝臟是維持血糖穩(wěn)定的重要器官。奶牛因產前肥胖造成脂肪蓄積于肝臟，引起肝糖原含量減少，糖異生作用減弱，產犢時大量的體能消耗導致血糖降低。血糖濃度的降低會導致脂肪被大量分解為游離脂肪酸，游離脂肪酸的不完全氧化會生成大量酮體[2]。奶牛分娩后常處于能量負平衡(NEB)狀態(tài)[3]，使得體脂動員產生的脂肪酸增多，肝臟只能利用一部分游離脂肪酸，合成過多的甘油三酯對肝臟產生浸潤，肝臟運行負荷過大，最終造成肝功能受損。奶牛酮病是NEB的結果，常呈高游離脂肪酸血癥、酮血癥、肝脂浸潤[4]。肝脂浸潤往往使能量代謝障礙更加嚴重[5]，引起血酮升高進而加重NEB的惡性循環(huán)。

酮病的發(fā)生給奶牛生產帶來嚴重的經濟損失，因此進行酮病有效監(jiān)測十分必要[6]。飼料營養(yǎng)的調整，飼養(yǎng)管理加強及產后護理措施的完善等，可顯著降低酮病的發(fā)病率，提高養(yǎng)殖效益。有報道稱，酮病在我國不同規(guī)模養(yǎng)殖場的發(fā)病率為16%～45%，并在產后2周內發(fā)病率達到最高[7]。然而，關于云南省奶牛酮病的流行情況還未曾報道。因此，本研究通過調查云南省昆明市某集約化養(yǎng)殖場奶牛酮病的發(fā)病情況，檢測酮病奶牛相關血液指標，分析酮病奶牛肝臟病理變化，為進一步了解云南省集約化奶牛場奶牛酮病發(fā)病規(guī)律和酮病診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 云南省昆明市某集約化奶牛場隨機選擇40頭，胎次為2胎～4胎待產且體況正常的荷斯坦奶牛。體況正常包括無異常臨床癥狀，脈搏、心跳、呼吸、體溫等生理指標正常。根據(jù)β-羥丁酸(BHBA)濃度進行分組：血酮濃度≥1.2 mmol/L為酮病組、血酮濃度

1.1.2 主要試劑與儀器 牛β-羥基丁酸(BHBA)、牛游離脂肪酸(NEFA)ELISA檢測試劑盒，上海酶連生物科技有限公司產品；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、白蛋白(ALB)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、高密度脂蛋白(HDL)、葡萄糖(GLU)測定試劑盒，深圳雷杜生命科技有限公司產品；酶標檢測儀，賽默飛世爾儀器有限公司產品；Chemray 800全自動生化分析儀，深圳雷杜生命科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 血液樣品采集 根據(jù)牛場管理軟件的預產時間，跟蹤采集產前5 d，生產當天，產后5 d，產后10 d的血液樣品。采集尾根靜脈血10 mL，肝素鈉抗凝，室溫下以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液于EP管，分成2份，1份用于ELISA檢測，另1份用于其他指標檢測。置-80℃冰箱內凍存待檢。

1.2.2 血液指標檢測 ELISA操作步驟按試劑盒說明書進行，用酶標檢測儀檢測。用Chemray800全自動血液生化分析儀對生化指標進行測定。

1.2.3 酮病牛肝臟病理切片制作 將酮病組死亡和淘汰的牛解剖，在牛的右季肋區(qū)，從第5肋骨至第13肋骨之間的位置，用組織剪剪下部分肝組織，放入40 g/L多聚甲醛溶液中固定。

取出40 mL/L多聚甲醛固定好的組織樣本用流水沖洗，梯度酒精依次脫水。750 mL/L酒精2 h、850 mL/L酒精2 h、900 mL/L酒精1.5 h、950 mL/L酒精2 h、無水乙醇Ⅰ 2 h、無水乙醇Ⅱ 2 h、醇苯40 min、二甲苯Ⅰ 40 min、二甲苯Ⅱ 40 min、65℃融化石蠟Ⅰ 0.5 h、65℃融化石蠟Ⅱ 1 h、65℃融化石蠟Ⅲ 3 h然后包埋成蠟塊。使用切片機切3 μm～5 μm厚石蠟切片，65℃烤片4.5 h；切片入蘇木素染液染3 min～5 min，自來水洗，分化液分化，自來水洗，返藍液返藍，流水沖洗；切片依次入850 mL/L、950 mL/L的梯度酒精脫水各5 min，入伊紅染液中染色5 min；切片依次放入無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅲ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min，透明中性樹膠封片；光學倒置顯微鏡觀察，選取目標區(qū)域進行拍照，分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)用SPSS20.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)結果均以平均數(shù)±標準差表示。兩個組各時間點的試驗數(shù)據(jù)采用比較平均值成對樣本t檢驗，各時間點的試驗數(shù)據(jù)檢測結果用GraphPad Prism8.4.0軟件進行對比作圖。

2 結果

2.1 酮病發(fā)病情況

40頭奶牛產前5 d和生產當天，血酮值均低于1.2 mmol/L，無酮病發(fā)生；產后5 d，酮病奶牛有9頭，發(fā)病率為22.5%；產后10 d，新增發(fā)病奶牛10頭，酮病奶牛有19頭，發(fā)病率為47.5%。發(fā)生酮病的19頭牛為酮病組，另外21頭健康牛為健康組(圖1)。其中酮病組1頭奶牛在產后第13 d因出現(xiàn)神經癥狀被淘汰，1頭在產后第15 d突然發(fā)生猝死。產犢后記錄奶牛從分娩后第1天至產后第60天每天的泌乳量，酮病奶牛平均每天產奶27.19 kg±1.33 kg，健康奶牛平均每天產奶32.06 kg±1.55 kg。

*P<0.05，**P<0.01

2.2 BHBA濃度變化

在分娩當天，酮病組BHBA濃度為0.82 mmol/L±0.04 mmol/L，健康組BHBA濃度為0.67 mmol/L±0.05 mmol/L，組間差異不顯著，兩組奶牛均未發(fā)??；產后5 d，健康組BHBA濃度為(0.84±0.05)mmol/L，酮病組為1.28 mmol/L±0.16 mmol/L，酮病組極顯著高于健康組(P<0.01)；產后10 d，酮病組BHBA持續(xù)上升為1.48 mmol/L±0.18 mmol/L，健康組為0.74 mmol/L±0.05 mmol/L，酮病組極顯著高于健康組(P<0.01)。

2.3 能量指標變化

產前5 d、生產當天和產后5 d的NEFA濃度無明顯變化。產后10 d，酮病組NEFA濃度急劇升高，酮病組為1.1 mmol/L±0.40 mmol/L，健康組為0.64 mmol/L±0.45 mmol/L，酮病組極顯著高于健康組(P<0.01)；產前5 d，健康組和酮病組GLU濃度在4.0 mmol/L以下，生產當天兩組GLU濃度均急劇升高，組間差異不顯著。產后5 d，健康組濃度降至3.18 mmol/L±0.88 mmol/L，酮病組濃度降至1.97 mmol/L±0.12 mmol/L，組間差異顯著；產后10 d，酮病組顯著低于健康組(P<0.05)(圖2)。

2.4 肝功能指標變化

圖2酮病組與對照組NEFA(A)、GLU(B)的變化曲線

健康組和酮病組AST、TG、ALT、TBIL和ALB濃度變化見圖3，健康組和酮病組AST在產前10 d、產前5 d、生產當天均無顯著差異。產后10 d AST濃度上升，酮病組為128.64 μ/L±6.11 μ/L，健康組為105.24 μ/L±3.23 μ/L，組間差異極顯著(P<0.01)；酮病組和健康組產前5 d至生產當天TG濃度急劇下降，并持續(xù)至產后5 d。產后10 d，健康組下降為0.11 mmol/L±0.0047 mmol/L，酮病組上升為0.15 mmol/L±0.0067 mmol/L，酮病組顯著高于健康組(P<0.05);健康組和酮病組在監(jiān)測時間內ALT、TBIL、ALB濃度未出現(xiàn)顯著性差異。兩組TBIL濃度在生產當天均有一定程度的上升，之后逐漸下降至正常水平。

2.5 高密度脂蛋白、對氧磷酶1變化

HDL、PON-1變化見圖4，健康組和酮病組在監(jiān)測期內差異不顯著，生產當天HDL濃度下降到最低；產前5 d到產后10 d,PON-1呈一個逐漸上升的趨勢，產后10 d，酮病組對氧磷酶1濃度為4.87 mg/mL±0.17 mg/mL，健康組為5.56 mg/mL±0.22 mg/mL，酮病組顯著低于健康組(P<0.05)。

2.6 酮病奶牛肝臟病理學變化

酮病奶牛肝臟均勻性增大，邊緣鈍而厚，表面光滑，質如面團，表面呈黃紅色和灰黃白色，有油膩感。刀切時，硬度較健康肝臟稍增加，刀面有脂肪沾染。切面呈黃紅或淡黃色，有油膩感(圖5)。健康奶牛肝組織結構基本正常，肝細胞結構飽滿，未見明顯水腫固縮壞死等變性(圖6)，酮病奶牛圖(圖6C、圖6D)肝組織整體結構異常，肝細胞結構疏松，組織可見大量肝細胞脂肪變性，脂變的肝細胞胞漿內出現(xiàn)大小不等的脂滴。脂肪變性初期脂滴較小，逐漸變大后，緊密分布于胞漿內，病變明顯部位可見空泡樣(箭頭所示)；酮病奶牛的肝組織整體結構異常，組織肝細胞結構疏松，可見肝細胞廣泛水腫(圖6E、圖6F)箭頭所示; 部分肝細胞核固縮溶解消失。

3 討論

酮病是奶牛圍產期普遍發(fā)生的一種代謝性疾病，酮病的發(fā)病因素有很多，包括產前過度肥胖、機體能量負平衡(NEB)、營養(yǎng)不均衡等[8]。奶牛在圍產期經歷妊娠、分娩、泌乳等一系列變化，干物質攝入較少，但泌乳對能量的需求較高，采食量不能滿足泌乳需求而出現(xiàn)能量負平衡，機體只能通過動用脂肪和蛋白質來滿足需求，結果導致乙酰乙酸和β-羥丁酸的生成過多而引起酮病[9]。該集約化養(yǎng)殖場干奶期的飼養(yǎng)密度較大，奶牛運動量小，導致了奶牛胖瘦不均。研究表明，放牧的奶牛酮病發(fā)病率低于集約化養(yǎng)殖的奶牛[10]。奶牛產犢后開始泌乳，由于奶牛食欲恢復較慢，攝入的能量和葡萄糖還不能完全滿足泌乳需求，從而導致血糖迅速下降。在本次研究中，酮病組GLU濃度在產后5 d、10 d顯著低于健康組，呈現(xiàn)低血糖癥，這與楊威等研究結果一致[11],GLU濃度在分娩時突然升高，之后又迅速下降，這與遲景波等研究結果相吻合[12]。

ALT、AST可作為反映肝細胞損傷及嚴重程度的指標[13]。在本次研究中，AST的含量在產后10 d極顯著高于對照組，并且從生產當天到產后呈逐漸上升的趨勢；ALT濃度雖然未表現(xiàn)顯著性差異，但酮病組ALT濃度在產后10 d高于對照組，表明產后10 d左右酮病組奶牛肝臟受損嚴重。酮病奶牛TG濃度在產后10 d顯著高于健康組，提示酮病奶牛肝臟有脂肪的蓄積。TG增加會引起肝臟狀態(tài)和功能的改變。酮病奶牛的肝臟常伴有腫脹，邊緣鈍圓，切面蒼白至黃色，并伴有腎臟、心肌和骨骼肌的大量TG浸潤[14]。對酮病奶牛進行肝穿刺病理檢查能夠評價酮病導致的肝臟炎癥和脂肪蓄積程度，評估病情，預測疾病進展。在平行于大轉子通過第10肋間空間的位置，能夠容易安全地實施經胸腔的針吸肝臟活組織檢查[15]。然而，活組織樣品檢測的主要缺點是目前沒有關于奶牛肝組織活檢風險評估的相關報道。從肝臟病理切片的觀察發(fā)現(xiàn)，酮病

圖3酮病組與健康組AST(A)、TG(B)、ALT(C)、TBIL(D)、ALB(E)的變化曲線

圖4酮病組與健康組HDL(A)、 PON-1(B)的變化曲線

圖5酮病奶牛的肝臟

奶牛肝細胞腫大，充滿大量大小不一的脂滴。肝細胞個體體積增大，細胞核固縮。引起細胞的結構和功能減弱，造成萎縮，壞死。通過對該場酮病奶牛病理切片分析，說明酮病奶牛肝臟存在嚴重的脂肪蓄積，出現(xiàn)器官實質性病變。

研究結果發(fā)現(xiàn)，酮病組奶牛血液中PON-1濃度與健康組相比顯著下降(P<0.05)，原因可能是圍產期奶牛的生理狀況，代謝水平發(fā)生了劇烈的變化，導致機體處于能量負平衡狀態(tài)，同時體脂會大量動員產生脂肪酸，在肝臟內質網和線粒體氧化中釋放大量的活性氧(ROS)。過多的ROS會造成抗氧化物的平衡失調，造成脂質間過度氧化，會產生大量有細胞毒性物質，引起肝細胞壞死，在肝臟受到損傷時，在血液中PON-1合成減少，活性下降，這可能是機體的氧化應激與PON-1活性成反比導致的結果。趙暢等在牛PON-1單克隆抗體夾心ELISA方法建立與初步應用的研究中，明確了血中 PON-1 可作為奶牛酮病發(fā)生的風險預警指標及其預警值為62.37 nmol/L[16]。酮病組奶牛血漿中的PON-1活性顯著低于健康組[17]。本次試驗關于PON-1的結果與先前的研究相一致，因此臨床檢測PON-1可能對奶牛酮病有一定的診斷價值。

圖6健康奶牛和酮病牛肝臟組織切片