牛源無乳鏈球菌分離鑒定與耐藥性分析

尹金花，李玫毅，吳 興，賀建忠*

(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.鄭州市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，河南鄭州 450053)

無乳鏈球菌(Streptococcasagalactiae)是引起奶牛乳房炎的重要病原菌之一[1]。該菌具有一定的傳染性，常定植于乳腺，主要引起隱性乳房炎的發(fā)生，導(dǎo)致SCC升高[2]。近年來，在我國多個(gè)地區(qū)的奶牛乳房炎乳樣中均分離到無乳鏈球菌[3-4]。雖然抗菌類藥物在奶牛乳房炎的防治中發(fā)揮了重要的作用，但抗生素的濫用使無乳鏈球菌產(chǎn)生耐藥性，給奶牛乳房炎的治療帶來困難[5-6]。本研究采集阿拉爾市某奶牛場乳房炎乳樣，用傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法進(jìn)行無乳鏈球菌的分離鑒定，并對鑒定的無乳鏈球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以期為牛場制定合理有效的乳房炎防控策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及菌株 樣品為新疆阿拉爾市某牛場62份隱性奶牛乳房炎乳樣。無乳鏈球菌ATCC13813標(biāo)準(zhǔn)菌株、金黃色葡萄球菌由塔里木大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)、MH(A)培養(yǎng)基、改良愛德華瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、脫纖維綿羊血，北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；2×Master Mix、DL 2000 Marker、細(xì)菌基因組提取試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌微量生化鑒定管、藥敏紙片，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；高壓滅菌器，日本 Hirayama公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；數(shù)碼生物顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及革蘭染色 將乳樣劃線接種于含50 mL/L綿羊血的TSA平板上，37℃培養(yǎng)24 h。將疑似為鏈球菌的菌落接種于含50 mL/L綿羊血的TSA平板上和改良愛德華培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)。挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.2.2 生化鑒定及觸酶試驗(yàn) 挑取單菌落接種于含有葡萄糖、蔗糖、乳糖、馬尿酸鹽、七葉苷的微量生化鑒定管中，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h～24 h，觀察并記錄結(jié)果。同時(shí)，在載玻片上滴1滴 3% H2O2，挑取單菌落與H2O2攪勻，進(jìn)行觸酶試驗(yàn)，產(chǎn)生氣泡者判定為陽性。

1.2.3 CAMP試驗(yàn) 將金黃色葡萄球菌橫線接種于含50 mL/L綿羊血平板，疑似鏈球菌與之垂直劃線接種，距離0.5 cm，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h～24 h，觀察并記錄。

1.2.4 PCR鑒定 將疑似鏈球菌單菌落接種于TSB培養(yǎng)基，37℃增菌培養(yǎng)后，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA，參照GenBank發(fā)表的cfb基因序列(Accession NO.NC-004116.1)，設(shè)計(jì)特異性引物，同時(shí)設(shè)計(jì)合成16S rRNA 通用引物(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，隨后送上海生工生物工程科技有限公司完成測序。將基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對分析。

表1 PCR引物列表

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 以無乳鏈球菌質(zhì)控菌株ATCC13813作為質(zhì)控菌，采用KB紙片法，取0.5麥?zhǔn)蠁挝坏?5 μL菌液涂布于MH(A)培養(yǎng)基，選取青霉素、慶大霉素、萬古霉素、氨芐西林、克林霉素、頭孢哌酮、紅霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、阿莫西林-克拉維酸10種抗菌藥敏片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及革蘭氏染色

挑選在改良愛德華培養(yǎng)基生長良好的單菌落，判定為疑似無乳鏈球菌。將疑似菌接種于在50 mL/L綿羊血瓊脂平板，可見灰白色、光滑、圓形、濕潤、隆起的小菌落，直徑0.5 mm～1 mm，形成溶血環(huán)，部分菌落無溶血環(huán)(圖1)。革蘭氏陽性，呈單個(gè)、成雙、鏈狀排列(圖2)。

圖1分離菌在血平板上的菌落形態(tài)

2.2 生化鑒定及觸酶試驗(yàn)

分離菌可分解乳糖、蕈糖，不分解山梨醇、馬尿酸鈉及七葉苷，觸酶試驗(yàn)均為陰性。結(jié)果與無乳鏈球菌的生化特性相符。

2.3 CAMP試驗(yàn)

CAMP試驗(yàn)中，無乳鏈球菌與金黃色葡萄球菌靠近的區(qū)域可見箭頭狀溶血增強(qiáng)區(qū)，12株無乳鏈球菌分離株的CAMP試驗(yàn)均為陽性(圖3)。

2.4 PCR鑒定

特異性基因cfb和16SrRNA基因的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，在681 bp和1466 bp左右可見特異條帶，與預(yù)期目的片段大小一致(圖4、圖5)。16S rRNA測序結(jié)果經(jīng)Blast比對分析，分離菌與GenBank中登錄的無乳鏈球菌序列同源性均超過99%，證實(shí)12株分離菌為無乳鏈球菌。

圖2分離菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(1000×)

圖3分離菌株的CAMP試驗(yàn)結(jié)果

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～12.分離菌株M.DNA Marker DL 2 000；1-12.Isolated strains

2.5 藥敏試驗(yàn)

藥敏結(jié)果顯示，12株無乳鏈球菌對抗生素藥物的敏感性有差異，對萬古霉素、阿莫西林-克拉維酸、頭孢哌酮和紅霉素敏感，對卡那霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星和氨芐西林中度敏感，青霉素和四環(huán)素耐藥(表2)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～12.分離菌株；13.陰性對照

3 討論

無乳鏈球菌專性寄生乳腺組織，具有高度傳染性，在我國各地區(qū)的乳房炎乳樣中均被分離出[7-8]，對其研究有著重要的意義。本文調(diào)查新疆阿拉爾某奶牛養(yǎng)殖場的無乳鏈球菌的感染情況，結(jié)果表明，無乳鏈球菌的分離率為19.35%。低于劉凱等相關(guān)學(xué)者在多個(gè)地區(qū)的分離率[3]，同樣也低于王蒴等在新疆地區(qū)的無乳鏈球菌感染率[7]。說明不同地區(qū)不同養(yǎng)殖場的分離率有較大差異。

病原菌分離鑒定工作對于奶牛養(yǎng)殖場病原菌的凈化以及快速制定合理有效的防控策略至關(guān)重要。病原菌培養(yǎng)分離和生化鑒定仍被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，但生化反應(yīng)項(xiàng)目較多，耗時(shí)耗力，且有些菌株生化反應(yīng)不典型，有一定的局限性。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR鑒定技術(shù)具有準(zhǔn)確性、快速性和靈敏度高、數(shù)據(jù)分析和解釋簡單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于病原菌的快速檢測[10-12]。目前PCR鑒定技術(shù)主要基于16S rRNA基因和細(xì)菌特異性基因，cfb基因可以編碼無乳鏈球菌毒力蛋白CAMP因子，有研究證實(shí)cfb基因比16S rRNA基因分辨力更高，更適用于無乳鏈球菌的鑒定[13]。本研究將傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法與現(xiàn)代分子技術(shù)相結(jié)合，共分離鑒定12株無乳鏈球菌。

表2無乳鏈球菌分離株藥敏性試驗(yàn)結(jié)果

目前，控制無乳鏈球菌感染主要采取提高飼養(yǎng)管理水平和抗生素應(yīng)用，但由于抗生素的濫用，造成了無乳鏈球菌耐藥菌株不斷產(chǎn)生，在我國很多地區(qū)均有報(bào)道[14-17]。本研究中無乳鏈球菌對青霉素耐藥率為58.30%，耐藥性差異可能與我國多數(shù)奶牛場在治療乳房炎時(shí)多次長時(shí)間應(yīng)用青霉素有關(guān)。此外，分離菌株對四環(huán)素的耐藥率達(dá)50.00%，可能由于牛場長期應(yīng)用四環(huán)素治療一些感染性疾病有很大的關(guān)系。本研究結(jié)果中，無乳鏈球菌對阿莫西林-克拉維酸鉀、頭孢哌酮、紅霉素敏感性較好，建議該牛場選擇以上3種藥物進(jìn)行交替用藥。但隨著我國一系列獸用抗生素規(guī)范性文件的出臺，抗生素濫用問題不容小覷，中國特色的中草藥、微生態(tài)制劑或疫苗將成為治療奶牛乳房炎的發(fā)展趨勢。