牦牛乳源人葡萄球菌的分離鑒定及遺傳進化分析

李小英，劉連杰，楊晶晶，顧慶云，劉曉強

(1.西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，西藏拉薩 850030；2.西藏昌都市卡若區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，西藏昌都 854000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase negative staphylococci,CNS)是存在于健康人皮膚、口腔及腸道的正常菌，一直被認為無致病性。但隨著介入性診斷技術(shù)、免疫抑制劑、廣譜抗生素等的廣泛應(yīng)用，該菌種引起的感染病例日益增多，被認為是醫(yī)院感染的重要病原菌。同時，也存在于養(yǎng)殖場的飼料及飲水中，葡萄球菌在養(yǎng)殖場的致病案例最為常見?，F(xiàn)已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)人葡萄球菌可導(dǎo)致人的多器官感染、化膿性感染以及敗血癥[1-3]，尤其是在植入人工假體的患者和免疫功能低下的新生兒中發(fā)病率較高[4-5]。人葡萄球菌致病因素與其他葡萄球菌相似，主要是因其在醫(yī)療器械或宿主組織上形成穩(wěn)定的生物被膜[6]。在人群中發(fā)現(xiàn)了其多重耐藥性表型，從而限制了治療方案的選擇[7-8]。從環(huán)境、野生斑頭鵝糞便和野貓中分離出人葡萄球菌[9-11]。人葡萄球菌亞種可通過SDS-PAGE或MALDI-TOF MS鑒定，且此方法快速、敏感[12]。本研究將牦牛乳中分離的人葡萄球菌進行了分離培養(yǎng)、革蘭氏染色、細菌鑒定、藥敏鑒定、動物試驗和遺傳進化分析，為牦牛乳房炎的防控與臨床治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡健康Balb/c小鼠10只，體重20 g±2g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 血瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色套裝、LB營養(yǎng)瓊脂和LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker，全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；Premix LA PCR酶，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品；細菌生化鑒定卡和藥敏紙片，法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺，浙江蘇凈凈化有限公司產(chǎn)品；DHP-9051電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品產(chǎn)品；PCR儀，美國BIO-RAD產(chǎn)品；C-32型厭氧罐、2.5L厭氧產(chǎn)氣袋，日本三菱MGC公司產(chǎn)品；VITEK-2全自動細菌鑒定藥敏儀，法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 2020年4月～6月從西藏拉薩某牦牛養(yǎng)殖場采集奶樣。采樣前先用溫水清洗采樣乳頭，再用碘酒消毒乳頭，并在清洗或消毒乳頭后均用消毒毛巾擦干。棄去采樣乳區(qū)的頭3把乳，然后采集乳樣5 mL～8 mL至滅菌離心管密封保存，并作好標(biāo)記，置于備有冰袋的泡沫盒中，送回實驗室進行細菌分離與鑒定。奶牛在采樣前未接受任何藥物治療。

1.2.2 病原菌分離 無菌采集患病牦牛乳2組。其中一組接種于血瓊脂培養(yǎng)基，放置厭氧培養(yǎng)罐，加入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋后密封厭氧罐，37℃倒置培養(yǎng)48 h，用于分離厭氧菌和兼性厭氧菌；另一組接種于普通LB培養(yǎng)基，放置于恒溫培養(yǎng)箱，37℃倒置培養(yǎng)18 h～24 h，用于分離需氧菌。在有菌落生長的培養(yǎng)基上，用無菌接種環(huán)挑取8個單菌落，重新接種到營養(yǎng)瓊脂平板中進行純化培養(yǎng)，并進行形態(tài)學(xué)分析。將純化培養(yǎng)后的菌落置于營養(yǎng)肉湯中進行增菌培養(yǎng)。

1.2.3 病原菌生化鑒定及藥敏試驗 無菌挑取單個菌落進行革蘭氏染色，染色后置于顯微鏡下觀察。根據(jù)革蘭氏染色結(jié)果，菌液濃度調(diào)整至0.50麥氏濃度，選用Mérieux細菌生化鑒定管和藥敏紙片，使用VITEK2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)分析。

1.2.4 病原菌致病性試驗 將病原菌接種于營養(yǎng)肉湯中進行增菌培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18 h。10只受試Balb/c小鼠隨機分為試驗組和對照組，每組各5只。試驗組腹腔接種0.1 mL濃度為1×108CFU/mL菌液。對照組腹腔接種相同體積的普通營養(yǎng)肉湯。接種后定時觀察、記錄發(fā)病情況。動物死亡或處死后，剖檢觀察各個組織器官的病理變化，并進行細菌分離。

1.2.5 病原菌16S rRNA序列測定 提取上述培養(yǎng)物的全基因組，采用細菌通用引物16S rRNA，預(yù)擴增目的基因大小約1 500 bp，PCR 擴增體系(總體積為50 μL)：Premix LA 25 μL，上下游引物各2 μL，去離子水20 μL，基因組1 μL。PCR擴增程序：98℃ 30 s；98℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，共30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。電泳后，將產(chǎn)物送至北京金唯智生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.6 病原菌遺傳進化分析 將16S rRNA測序結(jié)果在NCBI里進行Blast比對后，選取不同物種參考株33株(表1)用MEGA-X軟件，通過Neighbor-Joining方法，以Boostrap值(1000)進行進化樹可靠性分析。

表1參考序列

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)及鏡檢結(jié)果

在血瓊脂培養(yǎng)基上無菌落生長，在普通LB培養(yǎng)基上有菌落生長，說明致病菌為需氧菌。在普通LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)18 h后，挑取8個菌落進行純化，純化后的菌落無溶血現(xiàn)象，呈現(xiàn)白色、圓形、光滑的菌落,為革蘭氏陽性球菌(圖1)。

2.2 生化鑒定和藥敏試驗結(jié)果

生化鑒定結(jié)果為人葡萄球菌 (Staphylococcushominis)，鑒定分值為99%(表2)。分離菌對慶大霉素、環(huán)丙沙星、利奈唑啉、萬古霉素等12種抗菌藥物敏感,對克林霉素為中介,對紅霉素不敏感(表3)。

2.3 病原菌致病性試驗結(jié)果

試驗組小鼠7 d內(nèi)全部死亡,對照組小鼠無死亡,表明該分離菌株具有一定毒力。試驗組小鼠接種菌液12 h后出現(xiàn)運動遲緩、群聚扎堆等臨床癥狀。剖檢小鼠發(fā)現(xiàn)，腹腔積液渾濁，腎臟出現(xiàn)局部腫脹和出血，肺臟出現(xiàn)局部腫脹，肝臟出現(xiàn)局部出血，其他組織和器官未見明顯病變。取實質(zhì)性器官進行細菌學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)來源于病變腎臟的分離菌株在LB固體培養(yǎng)基上呈黃色、中間稍隆起、光滑濕潤、半透明狀的圓形小菌落，為革蘭氏陽性球菌。

2.4 16S rRNA序列測定及遺傳進化分析

16S rRNA的PCR擴增結(jié)果與預(yù)期相符，大小約為1 500 bp(圖2)，測序結(jié)果顯示為人葡萄球菌，并將所分離菌株命名為Tibet2018-S.h。從GenBank中選取不同種葡萄球菌參考株33株，將其16S rRNA基因序列進行多序列匹配排列，并進行同源性比較，繪制遺傳進化樹(圖3)，結(jié)果顯示分離菌株為人葡萄球菌，遺傳進化分析和測序結(jié)果與生化鑒定結(jié)果相符。

圖1革蘭氏染色結(jié)果(10×100)

表2分離菌生化試驗結(jié)果

表3分離菌藥敏試驗結(jié)果

M.DNA標(biāo)準DL 8 000；1.陰性對照；2.16S rRNA基因

3 討論

人葡萄球菌是人類重要的病原菌之一，發(fā)病頻率僅次于表皮葡萄球菌，是臨床病例中常見的分離菌株，在很多條件下都會引起感染，如血液[13-15]。我國對人葡萄球菌的研究較少，大部分人葡萄球菌對紅霉素和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑不敏感，少數(shù)對克林霉素不敏感，所有分離菌株對萬古霉素，利奈唑胺，達托霉素和替加環(huán)素均敏感[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，從牦牛乳中分離到的人葡萄球菌僅對紅霉素不敏感，對克林霉素中度敏感，對利奈唑胺、環(huán)丙沙星，左氧氟沙星等多種藥物敏感，說明人葡萄球菌與抗生素的使用有關(guān)。本研究藥敏試驗結(jié)果可以為該牦牛養(yǎng)殖場控制乳房炎致病菌耐藥性的傳播，指導(dǎo)選擇合適的抗菌藥物提供參考。此外，本牦牛養(yǎng)殖場急需采取嚴格的牦牛乳房炎防控措施，做好隱性乳房炎和乳房炎的監(jiān)測，以提高牦牛養(yǎng)殖水平和生鮮牦牛乳的質(zhì)量。同時嚴格控制獸藥在飼養(yǎng)過程中的使用，并遵守安全休藥期，對降低食源性耐藥菌株的出現(xiàn)有著重要意義。

圖3 16S rRNA基因序列遺傳進化分析