豬源嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌分離鑒定及致肺臟病理損傷分析

任建樂，姬 康，楊 瑾，姚繼英，王 穎，趙宇軍，田文霞

(山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西太谷 030801)

豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease complex，PRDC)是由病毒、細菌、環(huán)境、遺傳和飼養(yǎng)管理等多種因素相互作用而引發(fā)的呼吸道疾病總稱[1]。其中病毒或支原體等原發(fā)性病原可引起一種或者多種細菌繼發(fā)感染，使豬群發(fā)病率和死亡率增高，增加了PRDC的復雜性和防控難度，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)屬黃單胞菌科、寡養(yǎng)單胞菌屬，為非發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌。該菌廣泛存在于水、土壤、食物、植物以及人和動物的皮膚、呼吸道和胃腸道，是一種對低免疫功能者的高發(fā)病率和病死率的條件致病菌，感染人可引起肺炎、敗血癥、心內膜炎和尿路感染等疾病[2]。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌可對多種抗生素耐藥，已被世界衛(wèi)生組織(WHO)認定為醫(yī)院中最低估的重要多重耐藥菌之一[2]。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌在早期獸醫(yī)診斷中并不常見，但近年來國內外陸續(xù)有該菌引起動物患病或死亡的報道。感染魚類可引起敗血癥和死亡[3]。在陸生動物方面，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌感染山羊引起淋巴或其他組織器官的炎癥反應[4]。感染犬前列腺可導致生殖障礙[5]。2004年首次在豬體內分離到嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌[6]。本研究在感染豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)的仔豬心包積液中分離到1株豬源嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，并對其耐藥性和小鼠肺臟損傷進行了分析，以期為豬場嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的治療及PRDC防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和實驗動物 山西臨汾某豬場患有呼吸道綜合征的死亡豬；6周齡～8周齡SPF級Balb/c雌性小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑 藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；細菌微量生化反應管，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；pEasy-Blunt載體、大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)，北京全式金生物公司產(chǎn)品；革蘭氏染色液，北京索萊寶科技公司產(chǎn)品；2×Vazyme LAmp Master Mix，南京諾唯贊生物公司產(chǎn)品；反轉錄試劑盒和DL 2 000 Marker，大連寶生物公司產(chǎn)品；病毒DNA/RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺，蘇州凈化有限公司產(chǎn)品；PCR擴增儀和小型高速離心機，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；細菌恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品；凝膠成像分析儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病死豬剖檢及病毒基因PCR檢測 固定死豬尸體，打開胸腔和腹腔，觀察臟器的病理變化，采集心臟、肺臟和脾臟等組織，其中一部分凍存于-80℃冰箱備用，另一部分進行組織研磨，用于病毒核酸提取和RT-PCR或者PCR檢測，引物由北京擎科生物西安分公司合成(表1)。

表1引物序列

1.2.2 細菌的分離純化及染色鏡檢 無菌接種環(huán)采取病豬心包積液，劃線于TSA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后，挑單菌落繼續(xù)劃線純化，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。此外，挑取單菌落進行革蘭氏染色，觀察細菌的染色特點和個體形態(tài)，染色操作參照試劑盒說明書進行。

1.2.3 細菌16S rRNA基因測序鑒定及遺傳演化分析 參考細菌16S rRNA通用引物擴增細菌的16S rRNA(表1)，采取菌落PCR的方法進行PCR擴增，PCR反應體系和程序參照2×Vazyme LAmp Master Mix說明書進行。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的DNA條帶，連接到pEasy-Blunt載體上，進行測序和Blast比對分析；選取與分離菌株16S rRNA基因同源性高且不同來源的序列，進一步用MEGA5.0軟件構建進化樹，分析分離菌株的遺傳演化關系。

1.2.4 生化試驗 挑取已純化的菌落接種至細菌微量生化反應管，37℃培養(yǎng)24 h后，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，觀察生化反應管反應情況，分析結果。

1.2.5 藥敏試驗 用紙片擴散法對細菌分離株進行抗生素敏感性測定。擴大培養(yǎng)的菌液以1.0×107CFU/mL劑量均勻涂布于直徑10 cm的TSA培養(yǎng)基中，將抗生素藥敏紙片分別貼于平板上，每個平板貼4種～6種藥敏片，37℃培養(yǎng)24 h后，測量不同抗生素的抑菌圈直徑(mm)，根據(jù)藥敏紙片抑菌圈標準判定致病菌株對抗生素的敏感程度。

1.2.6 小鼠感染試驗 8只6周齡～8周齡SPF級Balb/c雌性小鼠隨機分為2組，試驗組5只，對照組3只，根據(jù)文獻[7-8]，試驗組每只小鼠腹腔注射0.2 mL 1.0×109CFU/mL劑量的菌液，對照組腹腔注射0.2 mL的無菌TSB培養(yǎng)基，試驗周期為7 d，觀察小鼠的臨床癥狀、死亡情況、剖檢及組織病理變化。用接種環(huán)采取死亡小鼠的肺臟病變部位，采用1.2.2方法進行細菌分離鑒定。

2 結果

2.1 病毒學診斷

病死豬胸腔和腹腔可見心包內有明顯積液，肺臟發(fā)生實變，出血，脾臟有明顯的壞死點(圖1A)。經(jīng)RT-PCR和PCR對病料進行PRRSV、CSFV、PCV2、PRV檢測(圖1B)，結果顯示，PCV2呈陽性，其余病毒均為陰性。

2.2 細菌學診斷及細菌分離鑒定

成功分離到1株細菌(SX21)，該菌株在TSA培養(yǎng)基中呈灰白色，菌落表面光滑圓形(圖2A)；革蘭氏染色結果表明，該菌為兩端鈍圓，短小的革蘭氏陰性桿菌(圖2B)。通過16S rRNA的PCR擴增、測序和Blast分析，該分離菌株與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的16S rRNA序列同源率達99%，判定分離菌株為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，然后將16S rRNA序列提交至GenBank中(GenBank accession number:OK178540)(圖2C)。為分析嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌分離株的遺傳演化關系，選取GenBank中不同來源的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌與分離株的16S rRNA序列進行進化樹分析。結果表明，分離株與已報道的豬源嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌參考株處于兩個不同的亞分支，與SJTH1(廢水源)、W18(土壤源)和SXG-1(雜交鱘源)處于同一亞分支(圖2D)。

2.3 生化試驗

分離株可利用麥芽糖、纖維二糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖和果糖作為碳源，與蜜二糖肉湯、鳥氨酸、賴氨酸、七葉苷、側金盞花醇、精氨酸雙水解酶、65 g/L的高鹽肉湯反應呈陽性。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》分析，該分離株符合嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的生化特性(表2)。

2.4 藥敏試驗

選取33種抗生素進行藥敏試驗，分離株僅對多黏菌素B、阿奇霉素、多西環(huán)素、鏈霉素、米諾環(huán)素、氧氟沙星、恩諾沙星和加替沙星敏感；對拉氧頭孢、萬古霉素、丁胺卡那、四環(huán)素、氯霉素表現(xiàn)為中等敏感；對包括頭孢曲松和氨芐西林在內的20種抗生素表現(xiàn)耐藥。該分離株與頭孢類、β-內酰胺類、氨基糖苷類等抗生素呈耐藥特征，對多肽類、四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素敏感(表3)。

A.臟器病理變化；B.病原PCR診斷結果；M.DNA標準DL 2 000；1.豬圓環(huán)病毒2型；2.豬偽狂犬病病毒；3.豬瘟病毒；4.豬繁殖與呼吸綜合征病毒；5.陰性對照

A.菌落形態(tài)；B.革蘭氏染色(100×)；C.16S rRNA PCR擴增(M.DNA標準DL 2000；1.細菌分離株；2.陰性對照)；D.16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

表2生化試驗結果

2.5 小鼠感染試驗

試驗組小鼠精神沉郁、被毛粗亂、呼吸急促，在4、5、12 h分別死亡1只小鼠，死亡率為60%。剖檢后可見肺臟實變和明顯出血點。HE組織染色顯示，肺臟出血、充血、肺泡消失、炎性細胞滲出等病理變化。表明嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌能引起小鼠典型的出血性肺炎，從死亡小鼠的肺臟中均能分離出嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(圖3)。

3 討論

本研究分離到1株豬源嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，對其遺傳特性、耐藥性和致病性分析發(fā)現(xiàn)，該分離株可能來源于環(huán)境污染物，其呈現(xiàn)多重耐藥特征，感染小鼠可引起肺炎和死亡，為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的治療和PRDC的防控提供參考。

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌廣泛存在于自然界，豬舍空氣中氣載需氧菌中以腸桿菌屬、假單胞菌屬和莫拉菌屬為主，其中假單胞菌屬中嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌為優(yōu)勢菌種，且在所調查的5個豬場中均能檢測到，含量高達45.5%～81.9%[9]。對豬精液中的細菌監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌具有較高的分離率[10]。因此，豬舍中嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌廣泛存在，有可能感染豬群。人源嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌是一種對低免疫功能者高發(fā)病率和死亡率的條件致病菌，感染人可引起肺炎、敗血癥、心內膜炎和尿路感染等疾病[2]。

本研究在感染豬圓環(huán)病毒2型的豬中分離到嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，該菌可引起小鼠肺臟的實變、充血、出血和肺炎等病理變化。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌分泌的蛋白酶有增強流感病毒感染的作用，致病性研究發(fā)現(xiàn)該菌與豬流感病毒共感染，可導致豚鼠鼻液中流感病毒載量升高，排毒期更長[11]。此外，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌可通過激活PD-1/PD-L1信號通路誘導T細胞衰竭進而抑制宿主T細胞免疫[12]。因此，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌與原發(fā)性病原共感染可能具有協(xié)同作用，該菌能否促進或者增強豬圓環(huán)病毒2型的復制和致病性有待進一步探討。本研究遺傳演化分析發(fā)現(xiàn)，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌SX21株與廢水源菌株SJTH和土壤源菌株W18在一個亞分支，而其他豬源參考毒株在另一個亞分支，預示患病豬感染豬圓環(huán)病毒2型后，繼發(fā)感染的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌可能來源于環(huán)境中的水源或者土壤。因此，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌作為條件致病菌，豬群的隱形感染可能存在一定的普遍性，減少原發(fā)性病原感染、應激或其他不良環(huán)境因素導致的豬群機體免疫力下降，將有助于減少PRDC的發(fā)生。

A～C.死亡小鼠肺臟；D～H.存活小鼠肺臟 A-C.Lungs of death mice；D-H.Lungs of survival mice

表3嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌藥敏試驗結果

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌分離株對頭孢類、β-內酰胺類、氨基糖苷類等耐藥，對多粘菌素B、阿奇霉素、多西環(huán)素、鏈霉素、米諾環(huán)素、氧氟沙星、恩諾沙星和加替沙星敏感。不同豬場中的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌對抗生素的耐藥程度不同，可能與臨床中使抗生素種類不同有關。豬源嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌有感染飼養(yǎng)人員的潛在危險，有研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場人源嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌對獸醫(yī)臨床常用的抗菌藥物耐藥水平較高，且表現(xiàn)出多重耐藥[13]。遺傳演化分析顯示豬場廢水中的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌株與人源菌株具有高度相似的遺傳特征[14]。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中要選擇合適的抗菌藥物，以減少耐藥菌株的出現(xiàn)，既有利于疾病的防控，也可降低人員感染風險。