LncRNA MIAT靶向調(diào)節(jié)miR-128-3p對心房顫動大鼠心室重構(gòu)和心肌纖維化的影響

邢佳儂，梁卓，邢愛君，劉俊蘭，彭宏超，張?zhí)鞓?，張春?/p>

心房顫動（atrial fibrillation，AF）為常見心律失常癥狀，易引發(fā)心力衰竭、腎功能損傷、動脈栓塞等并發(fā)癥，嚴重威脅患者生命健康［1-2］。心肌纖維化導(dǎo)致的心室重構(gòu)是AF的主要病理特征，多種炎性因子誘導(dǎo)并放大的炎癥反應(yīng)與其關(guān)系密切，抑制炎癥反應(yīng)可降低AF發(fā)生風(fēng)險，減輕心肌纖維化與心室重構(gòu)［3-4］。心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（myocardial infarction associate transcript，MIAT）是一種保守的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），在心肌梗死、AF等心血管疾病的發(fā)病及進展過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用；降低MIAT的表達可顯著減輕炎癥反應(yīng)，延緩心肌纖維化、心肌肥厚等病理改變，改善心力衰竭癥狀［5-6］。研究顯示，LncRNA MIAT在AF大鼠中表達顯著增加，下調(diào)MIAT能顯著緩解AF，減輕其誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和心肌纖維化［7］。miR-128-3p是MIAT的一個下游調(diào)控因子，其表達水平與MIAT呈負相關(guān)［8］。miR-128-3p作為一種重要的炎癥調(diào)控因子，與AF的發(fā)生、發(fā)展過程關(guān)系密切。過表達miR-128-3p可明顯抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［9］，還可降低轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）水平，進而抑制AF小鼠心房心肌組織纖維化進程［10］。由此可知，miR-128-3p是治療AF的一個重要作用靶點。目前，LncRNA MIAT可否通過靶向調(diào)節(jié)miR-128-3p表達，從而影響AF大鼠心室重構(gòu)和心肌纖維化尚鮮見報道。本研究通過建立AF大鼠模型，探究LncRNA MIAT靶向調(diào)節(jié)miR-128-3p對AF大鼠心室重構(gòu)和心肌纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SD雄性大鼠75只購自鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場［SCXK（豫）2019－0002］，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，6～7周齡，體質(zhì)量200～230 g。無水氯化鈣（貨號C7250）、乙酰膽堿（貨號G8320）、天狼星紅染色試劑盒（貨號G3632）購自北京索萊寶科技有限公司；白細胞介素（interleukin，IL）-6測試盒（H007）、IL-18測試盒（H015）、TGF-β1測試盒（H034-2）購自南京建成生物工程研究所有限公司；RNA提取液（貨號G3013）購自Servicebio公司；LncRNA MIAT siRNA質(zhì)粒、miR-128-3p siRNA質(zhì)粒、空載質(zhì)粒、miR-128-3p與U6引物、野生型miR-128-3p 3′-UTR報告質(zhì)粒、突變型miR-128-3p 3′-UTR報告質(zhì)粒、miR-128-3p 3′-UTR無義序列、LncRNA MIAT過表達質(zhì)粒、LncRNA MIAT空載質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；人心肌細胞（貨號CP-H076）、人心肌細胞完全培養(yǎng)基（貨號CM-H076）、含酚紅的0.25%胰蛋白酶溶液（貨號PB180224）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；LipofectamineTM2000（貨號11668019）、Opti-MEM培養(yǎng)基（貨號31985-070）購自美國Invitrogen公司；一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒（貨號B639277-0100）、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號E608001）購自上海生工生物工程股份有限公司；Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)（型號Myoheart）購自北京拜安吉科技有限公司；電子分析天平（型號FA1004）購自上海津平科學(xué)儀器有限公司；多功能酶標儀（型號Varioskan LUX）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；光學(xué)顯微鏡（型號Axiovert 200）購自德國ZEISS公司；冰凍切片機（型號CM1950）購自德國Leica公司；實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）系統(tǒng)（型號qPCR 96K）購自澳大利亞KEWLAB Pty Ltd公司等。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠模型制備及分組 將無水氯化鈣、乙酰膽堿加入生理鹽水中溶解混勻，得到含有10 g/L氯化鈣和33.66 mg/L乙酰膽堿的AF誘導(dǎo)液500 mL。取SD大鼠63只，以1 mL/kg舌下靜脈注射AF誘導(dǎo)液，隔日給藥1次，共給藥14次［11］。給藥結(jié)束后行心電圖檢測，造模成功大鼠共60只，以隨機數(shù)字表法分為模型組、LncRNA MIAT siRNA質(zhì)粒（MIAT）組、miR-128-3p siRNA質(zhì)粒（miR-128-3p）組、LncRNA MIAT siRNA質(zhì)粒+miR-128-3p siRNA質(zhì)粒（MIAT+miR-128-3p）組、空載質(zhì)粒組，每組12只。另取12只正常SD大鼠，舌下靜脈注射等劑量生理鹽水，作為對照組。參照文獻［10］及說明書：MIAT組尾靜脈注射LncRNA MIAT siRNA質(zhì)粒，miR-128-3p組尾靜脈注射miR-128-3p siRNA質(zhì)粒，MIAT+miR-128-3p組尾靜脈注射LncRNA MIAT siRNA質(zhì)粒和miR-128-3p siRNA質(zhì)粒，空載質(zhì)粒組尾靜脈注射LncRNA MIAT siRNA和miR-128-3p siRNA相對應(yīng)的空載質(zhì)粒，模型組和對照組大鼠尾靜脈注射與MIAT+miR-128-3p組相同劑量的生理鹽水，各組大鼠均每周給藥2次，共用藥2周。

1.2.2 大鼠心房肌電生理及左心室質(zhì)量指數(shù)檢測 以乙醚氣體麻醉各組所有大鼠，測量體質(zhì)量后斷頭處死，然后開胸采集心臟血液，4℃1 000×g離心15 min，取上清液，-80℃保存?zhèn)溆?；取出上述各組大鼠心臟置于Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)中，等其自主節(jié)律穩(wěn)定時，以氯化銀電極檢測左心房有效不應(yīng)期（effective refractive period，ERP）和90%動作電位時程（90%action potential duration，APD90）；將心房肌電生理水平檢測結(jié)束后的心臟左心室剪下，稱質(zhì)量，計算左心室質(zhì)量指數(shù)=左心室質(zhì)量/體質(zhì)量（mg/g）；剪下左心室心肌組織0.5 g，分組標記并保存在液氮備用；剩余心肌組織經(jīng)包埋、冰凍成塊后切5μm片備用。

1.2.3 天狼星紅染色檢測大鼠心肌組織纖維化程度 取1.2.2中各組心肌病理切片，室溫放置5 min、冰丙酮固定、30%蔗糖脫水后，加入天狼星紅染液，染色完成后封片，每張切片于200倍放大倍數(shù)下隨機讀取5個視野拍照，采用Image J分析并計算心肌膠原容積分數(shù)（collagen volume fraction，CVF）=膠原面積/所測視野總面積×100%。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗測定大鼠血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平 取1.2.2中的血清凍融后，參照試劑盒說明書測量IL-18、IL-6、TGF-β1水平。

1.2.5 qPCR檢測大鼠心肌組織miR-128-3p表達水平 提取1.2.2中心肌組織總RNA后，以反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR擴增實驗檢測miR-128-3p表達水平。反應(yīng)體系（20μL）：一步法qPCR主混合液10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.4μL、酶混合物0.65μL、RNA模板0.55μL、無RNA酶去離子水8μL。反應(yīng)條件：50℃反轉(zhuǎn)錄5 min，95℃預(yù)變性3 min；95℃10 s，60℃30 s，40個循環(huán)。選用U6做內(nèi)參，基因引物序列，見表1。

Tab.1 qPCR primer sequence表1 qPCR引物序列

1.2.6 LncRNA MIAT對miR-128-3p的靶向調(diào)控作用 TargetScan Release 7.2生物信息學(xué)研究顯示，LncRNA MIAT和miR-128-3p之間有結(jié)合位點。人心肌細胞快速凍融復(fù)蘇后300×g離心5 min，以專用的人心肌細胞完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，混勻后置于37.5℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。細胞融合度達到80%時進行傳代，接種在24孔培養(yǎng)板中，分為miR-128-3p無義+空載組（將miR-128-3p 3′-UTR無義序列+LncRNA MIAT空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人心肌細胞）、miR-128-3p無義+過表達組（將miR-128-3p 3′-UTR無義序列+LncRNA MIAT過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人心肌細胞）、miR-128-3p野生+空載組（將野生型miR-128-3p 3′-UTR報告質(zhì)粒+LncRNA MIAT空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人心肌細胞）、miR-128-3p野生+過表達組（將野生型miR-128-3p 3′-UTR報告質(zhì)粒+LncRNA MIAT過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人心肌細胞）、miR-128-3p突變+空載組（將突變型miR-128-3p 3′-UTR報告質(zhì)粒+LncRNA MIAT空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人心肌細胞）和miR-128-3p突變+過表達組（將突變型miR-128-3p 3′-UTR報告質(zhì)粒+LncRNA MIAT過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人心肌細胞），各組均遵照LipofectamineTM2000試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，測定各組細胞雙熒光素酶活性［7］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0.1軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較行單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌纖維化程度、心房肌電生理水平指標及CVF比較 對照組的心肌組織幾乎無纖維化，模型組的心肌組織產(chǎn)生纖維化變性。相比模型組，MIAT組大鼠的心肌組織纖維化減輕，miR-128-3p組大鼠的心肌組織纖維化加重，MIAT+miR-128-3p組大鼠的心肌組織纖維化無明顯變化。與對照組比較，模型組ERP、APD90降低，左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌CVF升高（P＜0.05）。與模型組比較，MIAT組ERP、APD90升高，而左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌CVF降低（P＜0.05），miR-128-3p組ERP、APD90降低，而左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌CVF升高（P＜0.05），空載質(zhì)粒組ERP、APD90、左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌CVF差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與MIAT組比較，MIAT+miR-128-3p組ERP、APD90降低，而左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌CVF升高（P＜0.05）。與miR-128-3p組比較，MIAT+miR-128-3p組ERP、APD90升高，而左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌CVF降低（P＜0.05）。見表2，圖1。

Tab.2 Comparison of atrial electrophysiological indexes,left ventricular mass index and myocardial CVF between the six groups of rats表2 各組大鼠心房肌電生理水平指標、左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌CVF比較 （n=12，±s）

Tab.2 Comparison of atrial electrophysiological indexes,left ventricular mass index and myocardial CVF between the six groups of rats表2 各組大鼠心房肌電生理水平指標、左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌CVF比較 （n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與MIAT組比較，d與miR-128-3p組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組MIAT組miR-128-3p組MIAT+miR-128-3p組空載質(zhì)粒組F ERP（ms）46.01±3.02 20.15±2.58a 43.57±3.64b 12.63±0.82b 22.08±2.16cd APD90（ms）65.13±4.81 48.94±3.97a 62.87±4.56b 37.58±2.01b 51.89±2.68cd左心室質(zhì)量指數(shù)（mg/g）12.20±2.01 21.05±3.48a 13.97±2.46b 29.03±2.85b 20.01±2.62cd心肌CVF（%）0.52±0.17 20.53±2.04a 3.74±1.23b 31.67±3.52b 18.91±2.19cd 19.78±2.27 351.599＊＊49.72±4.05 84.145＊＊21.67±2.34 61.401＊＊21.06±2.23 356.630＊＊

2.2 各組大鼠血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平比較 與對照組比較，模型組血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，MIAT組血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平降低（P＜0.05），miR-128-3p組血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平升高（P＜0.05），空載質(zhì)粒組血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與miR-128-3p組比較，MIAT+miR-128-3p組血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平降低（P＜0.05）。與MIAT組比較，MIAT+miR-128-3p組血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平升高（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of serum levels of IL-18,IL-6,TGFβ1 and expression of miR-128-3p in myocardial tissue between the six groups of rats表3 各組血清IL-18、IL-6、TGF-β1及心肌組織miR-128-3p水平比較 （n=12，±s）

Tab.3 Comparison of serum levels of IL-18,IL-6,TGFβ1 and expression of miR-128-3p in myocardial tissue between the six groups of rats表3 各組血清IL-18、IL-6、TGF-β1及心肌組織miR-128-3p水平比較 （n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與MIAT組比較，d與miR-128-3p組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組MIAT組miR-128-3p組MIAT+miR-128-3p組空載質(zhì)粒組F IL-18（μg/L）0.39±0.04 1.42±0.13a 0.43±0.09b 2.38±0.22b 1.39±0.18cd IL-6（μg/L）1.32±0.24 14.29±2.65a 1.97±0.43b 25.32±3.17b 13.14±3.01cd TGF-β1（ng/L）120.68±26.83 638.15±65.38a 125.49±28.16b 931.27±86.67b 629.82±70.54cd miR-128-3p 1.01±0.24 0.56±0.07a 0.96±0.19b 0.31±0.05b 0.59±0.08cd 1.44±0.26 228.185＊＊14.75±2.82 170.296＊＊635.91±72.08 321.152＊＊0.55±0.06 46.911＊＊

Fig.1 The degree of myocardial fibrosis detected by Sirius red staining(×200)圖1 天狼星紅染色檢測大鼠心肌纖維化程度（×200）

2.3 各組大鼠心肌組織miR-128-3p表達比較 與對照組比較，模型組心肌組織miR-128-3p表達水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，MIAT組心肌組織miR-128-3p表達水平升高（P＜0.05），miR-128-3p組miR-128-3p表達水平降低（P＜0.05），空載質(zhì)粒組miR-128-3p表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與miR-128-3p組比較，MIAT+miR-128-3p組心肌組織miR-128-3p表達水平升高（P＜0.05）。與MIAT組比較，MIAT+miR-128-3p組心肌組織miR-128-3p表達水平降低（P＜0.05），見表3。

2.4 MIAT對miR-128-3p的靶向調(diào)節(jié) TargetScan Release 7.2生物信息學(xué)研究顯示，LncRNA MIAT和miR-128-3p之間有結(jié)合位點，見圖2。與miR-128-3p野生+空載組比較，miR-128-3p野生+過表達組相對熒光素酶活性降低（P＜0.05）；miR-128-3p突變+空載組和miR-128-3p突變+過表達組、miR-128-3p無義+空載組和miR-128-3p無義+過表達組間相對熒光素酶活性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

Fig.2 Bioinformatics of TargetScan Release7.2 predicts the binding site between lncRNA MIAT and miR-128-3p圖2 TargetScan Release7.2的生物信息學(xué)預(yù)測LncRNA MIAT和miR-128-3p之間的結(jié)合位點

Fig.3 Relative luciferase activity of cells in each group圖3 各組細胞相對熒光素酶活性值

3 討論

AF可導(dǎo)致心房收縮、舒張功能減退，使心臟泵血功能明顯受損甚至喪失，患者會因心力衰竭而死亡。臨床主要通過導(dǎo)管消融術(shù)對AF進行治療，但費用高昂，且復(fù)發(fā)率高，因此積極探究AF發(fā)生、發(fā)展機制，尋找更有效的治療手段具有重要臨床價值［12-13］。本研究采用舌下靜脈注射氯化鈣-乙酰膽堿混合液的方法誘導(dǎo)AF大鼠模型，結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠的ERP、APD90降低，左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌CVF升高，表明大鼠出現(xiàn)心室重構(gòu)和AF癥狀，AF模型構(gòu)建成功。研究顯示，多種炎癥標志物在AF過程中升高，其引發(fā)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)是導(dǎo)致心肌纖維化改變，進而造成心室重構(gòu)的重要因素，采用免疫調(diào)節(jié)劑進行抗炎是治療AF的有效方法［14-15］。MIAT為一種調(diào)控炎癥的長鏈非編碼RNA，參與介導(dǎo)心力衰竭、AF等疾病的發(fā)病機制，可促進心力衰竭患者炎癥因子和心肌膠原合成，而沉默LncRNA MIAT可抑制炎癥，減輕心肌纖維化導(dǎo)致的心力衰竭［16］，緩解心房重構(gòu)，改善AF癥狀［17］。本研究結(jié)果顯示，相比模型組，MIAT組大鼠中LncRNA MIAT表達及IL-18、IL-6、TGF-β1水平降低，左心室質(zhì)量指數(shù)和CVF也降低，大鼠心肌電生理指標ERP、APD90水平升高，表明敲低MIAT表達可抑制炎癥，減少膠原合成，減輕心肌纖維化變性，進而改善心肌電生理功能，延緩心室重構(gòu)進程，減輕大鼠AF癥狀，證實了LncRNA MIAT參與調(diào)控AF發(fā)生、發(fā)展過程，提示MIAT是AF的重要治療靶點。

研究顯示，miR-128-3p可調(diào)控氧化應(yīng)激和炎癥的發(fā)生、發(fā)展，進而介導(dǎo)心肌梗死與AF等心肌損傷性疾病的發(fā)病過程，促進miR-128-3p表達可顯著降低致炎因子合成水平，減輕脂多糖誘導(dǎo)的心肌炎癥損傷［18］。過表達miR-128-3p可抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人心肌纖維化變性［10］。在心肌梗死小鼠中miR-128-3p下調(diào)，上調(diào)其表達可使小鼠心肌細胞免于凋亡［19］。另有研究顯示，MIAT可負向調(diào)控miR-128-3p的表達［20］。但miR-128-3p是否為MIAT介導(dǎo)AF發(fā)生及病情進展的下游分子靶點并不清楚。本研究結(jié)果顯示，相比模型組，miR-128-3p組中大鼠血清炎性因子IL-18、IL-6及致纖維化因子TGFβ1水平升高，且左心室質(zhì)量指數(shù)和CVF升高，大鼠心肌電生理指標ERP、APD90水平降低，表明下調(diào)miR-128-3p表達可促進炎癥進展，加重大鼠心室重塑和心肌纖維化；而敲低MIAT表達可提高心肌組織miR-128-3p表達，提示miR-128-3p參與介導(dǎo)敲低MIAT表達對AF的治療過程。另外，相比MIAT組，MIAT+miR-128-3p組大鼠ERP、APD90、心肌組織miR-128-3p表達均降低，左心室質(zhì)量指數(shù)、CVF、血清IL-18、IL-6及TGF-β1水平均升高，表明miR-128-3p siRNA質(zhì)粒與LncRNA MIAT siRNA質(zhì)粒合用時，miR-128-3p siRNA質(zhì)粒可減弱MIAT敲低對炎性因子表達的抑制作用，拮抗MIAT敲低對AF大鼠心室重塑和心肌纖維化的緩解作用，最終逆轉(zhuǎn)MIAT敲低對AF大鼠AF癥狀的改善作用。另外，雙熒光素酶報告基因試驗結(jié)果顯示，LncRNA MIAT對miR-128-3p具有靶向調(diào)節(jié)作用，表明敲低MIAT表達可通過提高心肌組織miR-128-3p表達而起到抑制炎癥作用，進而減輕AF大鼠心室重塑和心肌纖維化，改善心功能，揭示LncRNA MIAT可通過靶向調(diào)節(jié)miR-128-3p表達，介導(dǎo)AF引發(fā)的心室重構(gòu)和心肌纖維化過程。

綜上所述，LncRNA MIAT參與介導(dǎo)AF的發(fā)生、發(fā)展，敲低MIAT可上調(diào)miR-128-3p，減少炎性細胞因子與致纖維化因子合成，抑制心肌炎癥及纖維化，延緩心室重構(gòu)進程，最終改善AF癥狀，而靶向調(diào)控miR-128-3p表達是其發(fā)揮上述作用的分子機制之一。