大黃酸通過抑制CDK9/STAT3途徑防治低氧性肺動(dòng)脈高壓

陳馬云，姚一竹，朱琳，蔡朝陽，徐梓瑋，孫君委，王良興，黃曉穎

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325015

低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension, HPH）是一種嚴(yán)重的、危及生命的慢性心肺系統(tǒng)疾病[1]。HOU等[2]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶9（cyclin-dependent kinases 9, CDK9）通過誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-6 的產(chǎn)生和分泌，促使信號(hào)傳導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子3（signal transducers and activators of transcription 3, STAT3）和CDK9近端β-FBG啟動(dòng)子結(jié)合，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的功能。本課題組前期針對(duì)CDK9 蛋白進(jìn)行中藥單體有效藥物篩選發(fā)現(xiàn)大黃酸可顯著抑制CDK9 蛋白表達(dá)。近年來，STAT3 被報(bào)道在HPH血管重塑中扮演重要角色[3]。有研究表明大黃酸可通過抑制STAT3的磷酸化進(jìn)而抑制多種腫瘤的增殖和誘導(dǎo)其凋亡[4]。但是大黃酸是否通過抑制CDK9以及STAT3磷酸化從而抑制HPH鮮見相關(guān)研究。因此，本項(xiàng)研究探索了HPH大鼠模型中大黃酸通過CDK9/STAT3途徑對(duì)HPH的改善作用以及相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～300 g，購買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2020-0014。RIPA裂解緩沖液、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、蛋白酶磷酸酶抑制劑和ECL超敏化學(xué)發(fā)光底物購買于美國Thermo Fisher Scientific公司，大黃酸單體購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。兔源性STAT3、p-CDK9、CDK9、PCNA、Bax、β-tubulin和Caspase-3抗體購買于美國CST公司，p-STAT3抗體購買于美國Abcam公司，Bcl-2 抗體購買于美國Affinity公司，CC-3抗體購買于美國Proteintech公司。

1.2 動(dòng)物分組及造模 18只SD大鼠分為3組，每組6只，分為常氧組（N）、低氧組（H）、低氧+大黃酸組（HR）。N組飼養(yǎng)于正常SPF環(huán)境；H組和HR組均飼養(yǎng)于同一SPF級(jí)環(huán)境的低氧艙，維持O2濃度為9.0%～11.0%，用無水氯化鈣防止低艙內(nèi)濕度過高，CO2濃度小于5.0%，總造模時(shí)長為4周，每日造模24 h。HR組在造模前，腹腔注射大黃酸，劑量為30 mg/kg，N組、H組大鼠均被腹腔注射等體積溶媒。每日觀察SD大鼠進(jìn)食、飲水情況及運(yùn)動(dòng)、精神狀態(tài)。

1.3 肺動(dòng)脈壓力測(cè)定及右心肥厚指數(shù)檢測(cè) 取SD大鼠，稱量體質(zhì)量后，按照體質(zhì)量計(jì)算20%烏拉坦注射液劑量，腹腔給藥，注射麻醉后固定大鼠，待其刺激無痛感后，分離出右頸外靜脈，行右心導(dǎo)管法測(cè)量肺動(dòng)脈平均壓（mean pulmonary artery pressure, mPAP），退出導(dǎo)管并結(jié)扎血管。檢測(cè)完肺動(dòng)脈壓力后，剝離大鼠心臟，去除多余組織后，分離左心室和室間隔（left ventricle+septum,LV+S）、右心室（right ventricle, RV），經(jīng)枸櫞酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline, PBS）洗凈血液后經(jīng)濾紙吸干進(jìn)行稱重（注意保持吸干程度的一致性），記錄右心室和左心室及室間隔重量后，按照公式計(jì)算右心肥厚指數(shù)，公式為：右心肥厚指數(shù)=[RV/（LV+S）][5]。

1.4 肺血管結(jié)構(gòu)重塑指標(biāo)檢測(cè) 取大鼠肺組織后，完整分離右肺上葉，將肺組織完全浸泡在4%多聚甲醛，常溫放置24 h，按步驟逐步脫水等處理后進(jìn)行石蠟包埋切片。將石蠟切片進(jìn)行HE染色，制片染色完成后將玻片放在顯微鏡下觀察，隨機(jī)拍攝肺中小動(dòng)脈。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖片，測(cè)量肺中小動(dòng)脈管壁面積（vessel wall area, WA）及管總面積（vessel total area, TA），計(jì)算管壁面積/管總面積（WA/TA），該比值可反映大鼠的肺血管結(jié)構(gòu)重塑的程度。方法同既往報(bào)道[6]。

1.5 Western blot檢測(cè)p-STAT3、STAT3、p-CDK9、CDK9、PCNA、Bcl-2、Bax、Caspase-3、CC-3 蛋白表達(dá)量 取各組大鼠等量肺組織勻漿后提取總蛋白，測(cè)定各個(gè)樣本的總蛋白濃度。取組織蛋白樣本10 μg行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜至PVDF膜后，將PDVF膜放入提前配制的封閉液中封閉，封閉結(jié)束后TBST清洗，放入一抗中孵育8 h以上，孵育時(shí)溫度保持在4 ℃。第2天經(jīng)TBST清洗后用二抗孵育，洗膜后用化學(xué)發(fā)光成像儀對(duì)PVDF膜進(jìn)行曝光。曝光后使用凝膠圖像分析軟件分析并測(cè)定條帶的灰度值，以β-tubulin為內(nèi)參，測(cè)定目的蛋白的灰度值以及與其對(duì)應(yīng)β-tubulin的灰度值，前者與后者的比值即為該組目的蛋白的相對(duì)蛋白表達(dá)量，并進(jìn)行比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均用±s表示，并進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)判斷是否服從正態(tài)分布，同時(shí)方差齊性檢驗(yàn)判斷參數(shù)是否能用于評(píng)估總體。多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠mPAP、右心肥厚指數(shù)比較 與N組比，H組大鼠mPAP和右心肥厚指數(shù)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與H組比，HR組大鼠mPAP和右心肥厚指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 3組大鼠mPAP和右心肥厚指數(shù)比較

2.2 3組大鼠肺細(xì)小動(dòng)脈重塑程度的比較 與N組（0.467±0.046）比，H組大鼠WA/TA（0.790±0.033）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與H組比，HR組大鼠WA/TA（0.574±0.022）明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；N組肺動(dòng)脈平滑肌層未見顯著增厚，動(dòng)脈管壁的厚度均勻一致；H組的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞可見增生，管腔狹窄，管壁顯著增厚；HR組相比H組血管肌化可見減輕，管壁增厚程度下降，管腔狹窄不明顯，見圖2。

圖2 3組大鼠肺血管HE染色圖（×400）

2.3 3組大鼠肺組織勻漿p-STAT3/STAT3、p-CDK9、CDK9蛋白表達(dá)水平比較 與N組比，H組大鼠肺組織勻漿的p-STAT3/STAT3、p-CDK9、CDK9表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與H組比，HR組大鼠肺組織勻漿的p-STAT3/STAT3、p-CDK9、CDK9表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 3組大鼠肺組織勻漿p-STAT3/STAT3和p-CDK9、CDK9蛋白條帶圖及各組間比較圖

2.4 3組PASMCs和大鼠肺組織勻漿增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與N組比，H組大鼠肺組織勻漿的PCNA、Bcl-2表達(dá)顯著增加，而Caspase-3、CC-3、Bax表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與H組比，HR組大鼠肺組織勻漿的PCNA、Bcl-2表達(dá)顯著減少，而Caspase-3、CC-3、Bax表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 3組大鼠肺組織勻漿PCNA、Caspase-3、Bcl-2、Bax、CC-3蛋白條帶圖及各組間比較圖

3 討論

肺動(dòng)脈高壓是一種以肺血管阻力持續(xù)增加伴隨肺血管重塑為特征性變化的慢性肺部疾病[7]，目前臨床上雖已有藥物用于治療肺動(dòng)脈高壓，但治療效果欠佳。因此迫切需要一種更為有效的治療藥物，并深入研究其作用機(jī)制和治療的有效靶點(diǎn)。

大黃酸是一種廣泛存在于大黃藥材中的蒽醌類提取物，其藥理作用廣泛，具有顯著的抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗纖維化、保肝、護(hù)腎等作用[8]。有研究報(bào)道大黃酸可有效抑制白細(xì)胞介素6刺激下血管平滑肌細(xì)胞的增殖效應(yīng)，并呈劑量和時(shí)間依賴性[9]。本研究發(fā)現(xiàn)大黃酸能有效減輕肺血管重塑和右心肥厚，使HPH大鼠的肺動(dòng)脈壓力降低。

CDK9 屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶家族的成員，它們不僅調(diào)控細(xì)胞周期，而且在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的過程中作為調(diào)控因子起著重要的作用。在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的過程中，能通過調(diào)節(jié)底物的磷酸化進(jìn)而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的延長和mRNA的成熟。有研究發(fā)現(xiàn)，人非小細(xì)胞肺癌（non-small-celllungcancer, NSCLC）組織中CDK9蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，在使用CDK9抑制劑和siRNA CDK9后，p-STAT3蛋白表達(dá)被抑制，而總的STAT3并無明顯下降。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明CDK9 與STAT3直接結(jié)合[10]。同時(shí)，HOU等[2]的研究也證實(shí)CDK9與STAT3的結(jié)合。提示CDK9在細(xì)胞信號(hào)通路中扮演重要角色，并可能是通過調(diào)節(jié)STAT3的表達(dá)產(chǎn)生作用。

STAT3是信號(hào)傳導(dǎo)活化轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員之一，其生物學(xué)作用廣泛，可被環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)（如低氧）、多種炎癥因子、生長因子等激活，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等信號(hào)的傳導(dǎo)[11-12]。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞是肺血管的主要成分，有研究發(fā)現(xiàn)，在肺動(dòng)脈高壓患者血管分離的PASMCs中STAT3蛋白的磷酸化水平增加，提示其參與肺動(dòng)脈高壓的形成和發(fā)展[13-14]。Bcl-2家族調(diào)節(jié)蛋白（包括促凋亡蛋白Bax等和抗凋亡蛋白Bcl-2等）是線粒體凋亡途徑重要的調(diào)控因子，起關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用，在各種促凋亡刺激下，促凋亡蛋白Bax等受到激活，破壞了線粒體膜的完整性，使線粒體內(nèi)部的蛋白如半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）激活劑、細(xì)胞色素C等蛋白被釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡[15]。正常生理情況下，細(xì)胞凋亡可以維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。越來越多的研究表明細(xì)胞凋亡抵抗出現(xiàn)在低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓中[16-17]，暴露于低氧的PASMCs中的抗凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)明顯增多，如Bcl-2，與之對(duì)應(yīng)的促凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)明顯受抑制，如Bax，進(jìn)而參與肺動(dòng)脈血管的重塑[18]。另有研究表明大黃酸可通過抑制人胰腺癌細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞中STAT3的磷酸化發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。近期研究還發(fā)現(xiàn)，大黃酸通過抑制STAT3途徑，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)而促進(jìn)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)來誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期[19]。因此，我們推測(cè)大黃酸可能通過CDK9途徑抑制STAT3的磷酸化從而影響PASMCs的增殖與凋亡達(dá)到抑制HPH的作用。本研究結(jié)果顯示，HPH大鼠肺組織中CDK9、p-STAT3表達(dá)上調(diào)，而應(yīng)用大黃酸后有效抑制了CDK9和STAT3的磷酸化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)低氧條件下PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)量較常氧明顯上調(diào)，Caspase-3、CC-3、Bax蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，而大黃酸能有效逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)的表達(dá)。這提示大黃酸減輕HPH可能與其抑制CDK9/STAT3途徑有關(guān)。

綜上所述，大黃酸可以通過抑制CDK9/STAT3途徑達(dá)到治療HPH的目的，為其在肺動(dòng)脈高壓防治策略中成為潛在有效藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)，大黃酸是否通過抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs異常增殖并促進(jìn)PASMCs凋亡機(jī)制參與緩解HPH有待進(jìn)一步研究。