202例急性淋巴細(xì)胞白血病兒童細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)

尹萌萌 劉愛(ài)國(guó) 張艾 王雅琴 胡群

急性淋巴細(xì)胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)為兒童時(shí)期常見(jiàn)的血液腫瘤疾病，在過(guò)去的十年中，分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)的大力發(fā)展使人們發(fā)現(xiàn)更多有關(guān)白血病的染色體核型及基因，增強(qiáng)了人們對(duì)白血病的生物學(xué)認(rèn)識(shí)，包括發(fā)病機(jī)制、診斷及預(yù)后等，促進(jìn)了臨床對(duì)患兒的精確個(gè)體化治療[1]。以往研究證實(shí)ALL兒童攜帶的染色體核型及融合基因，可作為白血病診斷和預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物[2]，但其在病人群體的分布特點(diǎn)，以及與患兒臨床特征的相關(guān)性，還有待進(jìn)一步研究。因此，本次研究對(duì)202例ALL兒童的細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行研究，分析其與臨床特征的相關(guān)性。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象

本科室2009～2015年診斷的202例ALL兒童，隨訪至2018年底，中位隨訪時(shí)間為5.9年。將本組ALL患兒分成3個(gè)年齡組：① 年齡≤1歲，②1歲<年齡≤6歲，③年齡>6歲。收集患兒細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果及臨床資料，包括性別、年齡、臨床危險(xiǎn)度及預(yù)后等。

2.ALL診斷及臨床危險(xiǎn)度分型標(biāo)準(zhǔn)

ALL診斷標(biāo)準(zhǔn)：骨髓涂片中，淋巴系細(xì)胞增殖異常，原始+幼稚淋巴細(xì)胞≥30%骨髓有核細(xì)胞，即可診斷ALL。

臨床危險(xiǎn)度分型標(biāo)準(zhǔn)：(1)低危ALL(low risk-ALL，LR-ALL)：不具有中危及高危因素。(2)中危ALL(intermediate risk-ALL，IR-ALL)：具有以下1項(xiàng)或多項(xiàng)者：①年齡≥10歲；②初診時(shí)白細(xì)胞≥50×109/L；③中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病；④T-ALL；⑤染色體數(shù)<45，或除t(12；21)、t(9；22)以外的異常染色體核型，或除t(4；11)以外的MLL基因重排。(3)高危ALL(high risk-ALL，HR-ALL)：具有以下1項(xiàng)或多項(xiàng)者：①年齡<12個(gè)月；②初診時(shí)白細(xì)胞≥100×109/L；③有t(9；22)染色體核型(BCR-ABL1融合基因)或t(4；11)染色體核型(MLL-F4融合基因)；④誘導(dǎo)緩解治療效果不佳。

3.檢測(cè)方法

(1)染色體核型：取骨髓細(xì)胞，采取R顯帶法后，顯微鏡下觀察中期分裂相細(xì)胞染色體核型，核型定義參照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名法體制(ISCN)1995》。

(2)免疫分型：選擇免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)，采用的單克隆抗體包括：T-ALL系：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8及TdT等。B-ALL系：CD10、CD19、CD20、CD23、及SmIg等。髓系：CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD117及cMPO等。

(3)融合基因：取患兒骨髓細(xì)胞，選擇熒光原位雜交技術(shù)(FISH)或逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)融合基因。

4.治療方案及預(yù)后分組

本組患兒均按照中華兒科雜志兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病診療建議(第三次修訂草案)治療[3]，異常染色體包括：超二倍體：染色體數(shù)目>46；亞二倍體：染色體數(shù)目<46。假二倍體：染色體數(shù)目為46條，存在結(jié)構(gòu)異常者。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告的染色體與預(yù)后關(guān)系將患兒進(jìn)行分組[4,5]：

①預(yù)后良好組：超二倍體，t(12；21)及正常核型；

②預(yù)后中等組：t(1；19)，假二倍體及其它簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)異常核型；

③預(yù)后差組：t(9；22),t(4；11)及亞二倍體。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，分類資料以百分比表示，并采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行組內(nèi)比較。Kaplan-Meier法評(píng)估患兒生存狀態(tài)及繪制生存曲線，各組生存率采用Log-rank檢驗(yàn)比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.基本情況

202例ALL患兒中，男性 136例，女性 66例，男女比例為2.1:1。患兒年齡0.6～16歲，中位年齡為 5.4歲。

2.ALL兒童細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)

本組患兒中，正常核型占67.8%(137/202)，異常核型占32.2%(65/202)，其中單純數(shù)目異常者占21.5%(14/65)，單純結(jié)構(gòu)異常者占35.4%(23/65)，數(shù)目及結(jié)構(gòu)均異常者占43.1%(28/65)。

本組患兒中，超二倍體占46.2%(30/65)，假二倍體占38.5%(25/65)，亞二倍體占15.3%(10/65)。異常結(jié)構(gòu)核型中，t(9；22)占9.8%(5/51)，t(1；19)占9.8%(5/51)，t(4；11)占3.9%(2/51)，t(12；21)占2%(1/51)，t(6；19)占3.9%(2/51)，t(3；17)占3.9%(2/51)，t(12；22)占2%(1/51)，t(6；12)占3.9%(2/51)及其它改變核型占60.8%(31/51)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同類型染色體核型構(gòu)成比例

融合基因陽(yáng)性占20.8%(42/202)。42例融合基因中，TEL/AML1占42.9%(18/42)，BCR/ABL1占23.8%，(10/42)，E2A/PBX1占23.8%(10/42)，SIL/TAL1占9.5%(4/42)，見(jiàn)圖2。

圖2 ALL兒童融合基因構(gòu)成比例

3.各年齡組ALL兒童細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)

本組患兒中，年齡≤1歲僅1例，1歲<年齡≤6歲共127例，年齡>6歲共74例。三組患兒的細(xì)胞遺傳學(xué)資料比較后發(fā)現(xiàn)，1歲<年齡≤6歲組患兒的異常染色體(37%vs23%，P=0.039)及超二倍體比例(18.9%vs8.1%，P=0.038)高于年齡>6歲組患兒，但BCR/ABL1比例較低(2.4%vs9.5%，P=0.026)，見(jiàn)表1。

表1 不同年齡組ALL兒童細(xì)胞遺傳學(xué)資料，n(%)

4.不同性別ALL兒童細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)

不同性別患兒之間的異常核型發(fā)生率無(wú)明顯差別(29.4%vs37.9%，P=0.227)，不同類型染色體及融合基因間分布無(wú)明顯差別(均P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同性別ALL兒童細(xì)胞遺傳學(xué)資料，n(%)

5.不同臨床危險(xiǎn)度ALL兒童染色體核型特點(diǎn)：

本組患兒中，LR 占25.7%(52/202)，IR 占32.2%(65/202)，HR占39.6%(80/202)，未知占2.5%(5/202)。不同臨床危險(xiǎn)度患兒的細(xì)胞遺傳學(xué)資料見(jiàn)表3，HR組中異常核型(42.5%vs40%vs9.6%，P<0.001)、亞二倍體(8.6%vs4.6%vs0%，P<0.001)及假二倍體比例明顯高于另外兩組患兒(22.6%vs9.2%vs1.9%，P<0.001)，IR組中超二倍體比例明顯高于另外兩組患兒(26.2%vs11.3%vs7.7%，P<0.001)。

表3 不同臨床危險(xiǎn)度ALL兒童細(xì)胞遺傳學(xué)資料，n(%)

6.融合基因與相應(yīng)染色體核型比較

本組18例TEL/AML1陽(yáng)性患兒中，超二倍體5例，亞二倍體1例，而t(12；21)僅有1例(5.6，1/18)。

10例BCR/ABL1陽(yáng)性患兒中，檢測(cè)出t(9；22)占50%(5/10)。攜帶t(9；22) 的患兒多伴有其它異常染色體結(jié)構(gòu)，如-7/del(7p)，9p異常，del(11p)，del(9)，dup(1q)和亞二倍體。

10例E2A/PBX1陽(yáng)性患兒中，測(cè)出t(1；19)占50%(5/10)，假二倍體3例，超二倍體2例，亞二倍體1例。

本組患兒未測(cè)出MLL基因，但測(cè)出2例患兒t(4；11)陽(yáng)性。同時(shí)，4例SIL/TAL1患兒中，未發(fā)現(xiàn)6q雜合性缺失、del(1q32)等異常結(jié)構(gòu)染色體核型。

42例融合基因陽(yáng)性患兒中，26.2%(11/42)患兒攜帶對(duì)應(yīng)的染色體核型。

7.臨床預(yù)后分析

截止隨訪時(shí)間，存活166例(82.2%，166/202)，死亡22例(10.9%，22/202)，失訪14例(6.9%，14/202)。統(tǒng)計(jì)不同染色體預(yù)后組的生存時(shí)間制作生存曲線，見(jiàn)圖3。對(duì)本組患兒從ALL診斷時(shí)間(2009—2015年)開(kāi)始隨訪，隨訪至2018.12.31，中位隨訪時(shí)間為5.9年。使用Log-rank檢驗(yàn)比較三組患兒生存時(shí)間，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。

圖3 三組不同染色體核型ALL患兒生存曲線比較

討論

隨著對(duì)ALL生物異質(zhì)性認(rèn)識(shí)的提高和生物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，ALL兒童的細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)得到了越來(lái)越多的關(guān)注。其中，染色體及基因與疾病進(jìn)展、治療及預(yù)后的相關(guān)性，已得到國(guó)際認(rèn)可。文獻(xiàn)中報(bào)道，ALL兒童的細(xì)胞遺傳學(xué)改變發(fā)生率約為30%～50%[6]，本組ALL兒童的染色體異常發(fā)生率為32.2%，基因突變率為20.8%，低于以往研究報(bào)道，可能是由于本組患兒診斷時(shí)間跨度較大，早期技術(shù)不成熟，而導(dǎo)致假陰性偏高。

染色體核型異常可表現(xiàn)在數(shù)目和/或結(jié)構(gòu)改變。本組患兒中，數(shù)目及結(jié)構(gòu)均異常者最多見(jiàn)(43.1%)。在異常遺傳學(xué)結(jié)果中，代表預(yù)后良好的超二倍體(46.2%)及TEL/AML1(42.9%)最多見(jiàn)，證明ALL兒童總體預(yù)后較好。

1.不同融合基因檢測(cè)及臨床特點(diǎn)

BCR-ABL1重排(Ph+)對(duì)應(yīng)的染色體易位為t(9；22)，40%～85%的t(9；22) 易位患兒同時(shí)伴有其它結(jié)構(gòu)異常[7]，但同時(shí)存在的異常結(jié)構(gòu)對(duì)預(yù)后的具體影響還尚無(wú)定論，有文獻(xiàn)認(rèn)為同時(shí)伴有-7/del(7p)或9p異常的預(yù)后更差，而伴隨超二倍體者可改善預(yù)后[8]。本組中，5例患兒伴有t(9；22)易位，合并的異常核型分別為del(11p)，dup(1q)，del(9)，-7/del(7p)和亞二倍體，與上述文獻(xiàn)報(bào)道有差異。如今，酪氨酸激酶小分子抑制劑的靶向治療可顯著改善此類患兒預(yù)后[9]。本組病例中，BCR/ABL1基因陽(yáng)性的患兒中僅一半患兒檢測(cè)出t(9；22)，可能是由于未觀察到分裂中期骨髓細(xì)胞，或是檢測(cè)技術(shù)不成熟導(dǎo)致[10]。

t(1；19)易位合并E2A-PBXl融合是兒童ALL中常見(jiàn)的染色體易位之一，伴t(1；19)異常的患兒，初診時(shí)多有腫瘤浸潤(rùn)及高白細(xì)胞血癥，預(yù)后欠佳，但近幾十年來(lái)，早期高強(qiáng)度的化療已改善t(1；19)患兒的預(yù)后[11]。本組患兒中，10例E2A/PBX1患兒僅測(cè)出5例t(1；19)，仍低于基因檢測(cè)陽(yáng)性率。t(12；21)易位導(dǎo)致ETV6-RUNX1(TEL-AML1)基因融合，此類患兒預(yù)后較好[1]。與TEL基因有關(guān)的染色體易位包括t(9；12)，t(12；22)和t(12；21)，最常見(jiàn)的是t(12；21)，發(fā)生于25%的B-ALL兒童中，但由于此易位位置隱蔽，常規(guī)染色體檢查陽(yáng)性率<1%，因此需結(jié)合FISH技術(shù)提高陽(yáng)性檢測(cè)率[10]，本組僅檢測(cè)出1例t(12；21)。

MLL基因中11q23重排各亞型因染色體易位不同具有明顯的臨床異質(zhì)性，但此類患兒預(yù)后均欠佳，造血干細(xì)胞移植也無(wú)法顯著改善其預(yù)后[12]。MLL基因中最常見(jiàn)的染色體改變?yōu)閠(4；11)(q21；q23)，此易位常伴有其它核型異常，特別是i(7)(q10)和+6，但并不進(jìn)一步影響患兒的預(yù)后。11q23易位常見(jiàn)的斷裂位點(diǎn)包括4q21，9p22，lp32，和19p13等[13]。本組患兒中，僅有1例嬰兒，攜帶的染色體為t(4；11)，但與其它基因陽(yáng)性的患兒相反，未檢測(cè)到MLL基因?？赡茉谟嘘P(guān)t(4；11)易位檢測(cè)中，染色體改變比基因突變更易發(fā)現(xiàn)。

有文獻(xiàn)表明，部分T-ALL兒童可攜帶SIL-TAL1基因，同時(shí)合并染色體6q雜合性缺失及del(1q32)，此類患兒易發(fā)生高乳酸血癥，但該融合基因?qū)LL的預(yù)后影響還未確定[14]。本次研究中，T-ALL患兒共20例，其中SIL-TAL1基因陽(yáng)性4例，未發(fā)現(xiàn)6q雜合性缺失，del(1q32)等異常結(jié)構(gòu)染色體核型，可能是受T-ALL病例數(shù)偏少影響。

在本組ALL兒童細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)中，42例陽(yáng)性融合基因僅發(fā)現(xiàn)11例對(duì)應(yīng)的染色體核型，一方面由于檢測(cè)技術(shù)，一方面由于染色體核型改變的隱蔽性，但也存在2例t(4；11)易位患兒未發(fā)現(xiàn)MLL基因，說(shuō)明在臨床中，不僅存在融合基因檢測(cè)陽(yáng)性率高于染色體分析的現(xiàn)象，也說(shuō)明ALL診斷準(zhǔn)確性的提高，需要結(jié)合多種細(xì)胞遺傳學(xué)方法綜合判斷。

2.不同臨床特征ALL患兒細(xì)胞遺傳學(xué)

了解了本組ALL兒童總體細(xì)胞遺傳學(xué)改變特點(diǎn)后，根據(jù)患兒的不同臨床特征分組，進(jìn)一步具體分析不同組患兒中的細(xì)胞遺傳學(xué)改變及分布特點(diǎn)。在臨床中，可觀察到ALL兒童的預(yù)后與年齡具有明顯的相關(guān)性，如在治療效果中，學(xué)齡前期及學(xué)齡期患兒優(yōu)于嬰兒期及青春期患兒。除了個(gè)人體質(zhì)、藥物耐受性及醫(yī)囑依從性的差異外，染色體及基因在不同年齡段患兒中是否也存在分布差別，需要我們比較分析。通過(guò)比較后發(fā)現(xiàn)，1歲<年齡≤6歲組患兒的異常染色體及超二倍體的分布比例高于年齡>6歲組患兒，而B(niǎo)CR/ABL1分布比例較低。本次分析結(jié)果不僅幫助臨床更好了解細(xì)胞遺傳學(xué)在不同年齡患兒中的分布差異，也進(jìn)一步解釋了學(xué)齡前期及學(xué)齡期患兒預(yù)后較好的原因。在不同性別患兒中，異常染色體及不同類型細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果分布均無(wú)差別，說(shuō)明在ALL兒童中，男性與女性患兒的預(yù)后無(wú)明顯差異，性別不能作為預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)，同時(shí)在治療方面也不需區(qū)別化療。

ALL兒童的臨床分型不僅取決于個(gè)人臨床特征，也取決于某些特定的染色體及基因。但攜帶某些特定染色體及基因的患兒，大多同時(shí)合并其它異常染色體核型，因此我們分析了不同臨床危險(xiǎn)度患兒的染色體核型特點(diǎn)，經(jīng)過(guò)比較后發(fā)現(xiàn)，HR組中異常核型、亞二倍體及假二倍體比例明顯高于另外兩組患兒，說(shuō)明HR組患兒多同時(shí)合并預(yù)后不良的核型，但I(xiàn)R組中超二倍體比例高于另外兩組患兒，一方面是由于HR組患兒中，預(yù)后良好的染色體核型偏少，另一方面是由于LR組患兒中，正常核型占有大部分。

本研究不僅發(fā)現(xiàn)染色體及基因在不同臨床特征ALL兒童中的分布特點(diǎn)，也進(jìn)一步證實(shí)了染色體與ALL預(yù)后的相關(guān)性，不僅強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞遺傳學(xué)在臨床中的作用，也為我們?cè)谂袛郃LL兒童預(yù)后時(shí)，提供了指導(dǎo)性意見(jiàn)。