不同群體女性盆底功能障礙性疾病患者盆底組織中膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ表達(dá)的研究

哈提古麗·尼斯?fàn)?祖木熱來提·艾尼瓦爾 米合日尼沙·買買提 韓莉莉

女性盆底功能障礙性疾病(pelvic floor dysfunction，PFD) 是一組由盆腔結(jié)締組織的損傷、退化或功能缺陷所引起的盆底器官解剖結(jié)構(gòu)及位置改變造成的婦科疾病，其中以性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)和盆底器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)最為常見，多發(fā)于中老年女性[1]。盆底肌肉群、筋膜、韌帶及其神經(jīng)構(gòu)成了復(fù)雜的盆底支持系統(tǒng)，其互相作用和支持，承托并保持子宮、膀胱和直腸等盆腔臟器于正常位置。膠原蛋白是韌帶和筋膜等支持結(jié)構(gòu)的主要成分，作為細(xì)胞支架，在細(xì)胞的黏附、生長、增殖方面，維持盆底支持組織的彈性和韌性起重要作用[2]。產(chǎn)后性功能障礙的發(fā)病率在不斷升高，可高達(dá)70.6%[3]。中國中老年婦女人群中POP總體患病率約30% ，而美國60歲以上女性群體中POP患病率高達(dá)50%[4]，是影響女性身心健康和生活質(zhì)量的重要公共衛(wèi)生問題。 目前國內(nèi)盆底功能障礙性疾病方面的研究較多但缺乏維族女性盆底組織中膠原蛋白結(jié)構(gòu)和成分等特異性方面研究，本研究通過對比研究維族、漢族女性盆底功能障礙性疾病患者盆底組織中膠原蛋白 Ⅰ、Ⅲ 表達(dá)，了解 PFD的發(fā)生與不同民族之間有無差別，為PFD病因提供理論依據(jù)，并為其治療提供新的方法和思路。

對象和方法

1. 研究對象：收集2017年12月—2018年12月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科收治的PFD需手術(shù)治療的維族患者和漢族患者各100例作為研究組，患者均無子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥等雌激素相關(guān)疾病，均無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺功能疾病等影響膠原含量與代謝的疾病等，均無陰道前、后壁修補(bǔ)等手術(shù)史。

2.實(shí)驗(yàn)方法：

(1)標(biāo)本采集。所有患者均在術(shù)中切取陰道壁組織、骶主韌帶組織約 0. 2 cm×0. 5 cm×0. 5 cm，標(biāo)本及時(shí)保存在-80℃冰箱內(nèi)。

(2)實(shí)驗(yàn)材料。TIANScript RT Kit 購自中國天根公司；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)購自中國天根公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自中國Solarbio公司；Anti-Collagen Ⅰ抗體(ab138492)購自美國Abcam公司；Anti-Collagen Ⅲ抗體(ab7778)購自美國Abcam公司；Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(ab6721)購自美國Abcam公司；人Ⅰ型膠原(Col Ⅰ) ELISA試劑盒(購自美國Cusabio公司)；人Ⅰ型膠原(Col Ⅲ) ELISA試劑盒(購自美國Cusabio公司)。

(3)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血漿中Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ。采血針穿刺患者靜脈，使用一次性醫(yī)用真空EDTA-采血管采靜脈血，將靜脈血分裝至2支采血管內(nèi)，每支3 mL，在低速離心機(jī)上3000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心10 min，分離血漿，-80℃保存,ELISA法按照試劑說明書檢測Collagen Ⅰ、Ⅲ表達(dá)水平。

(4)免疫組化實(shí)驗(yàn)方法來檢測陰道壁組織和骶主韌帶組織內(nèi)Collagen Ⅰ、Ⅲ的蛋白表達(dá)情況。切片常規(guī)脫蠟水化，加3%H2O2室溫處理10 min，在枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)中微波加熱10 min(92～98 ℃)進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后5%小牛血清室溫處理10 min，分別滴加1∶100稀釋的Collagen I兔多克隆抗體，1∶100稀釋的兔單克隆抗體Collagen Ⅲ，4 ℃孵育過夜，再分別滴加1∶200稀釋的羊抗鼠或羊抗兔二抗，室溫處理30 min，再加SP(1∶100)工作液室溫處理30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片后在顯微鏡下觀察并攝片。

(5)RT-qPCR方法來檢測陰道壁組織和骶主韌帶組織內(nèi)Collagen Ⅰ、Ⅲ的mRNA RT-qPCR。通過DNAMAN軟件設(shè)計(jì)Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、GAPDH熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物，并由上海生工有限公司合成。分別加入2ul 5×PrimeScript Buffer，0.5ul PrimeScript RT Enzyme Mix I，0.5 ul Oligo(dT)15(15μM)，0.5 ulRandom 6 mers(100μM)，Total RNA 500 ng，RNase Free dH2O達(dá)到10ul，混勻后短暫離心，在PCR儀上37 ℃溫浴15 min，85 ℃加熱5 s，稀釋至35 μL，得到反轉(zhuǎn)錄的cDNA。qPCR反應(yīng)：Forward primer 10 μM 0.8ul，0.8 ul Reverse primer 10μM，2XSYBR Select Master Mix(2×) 10ul，RNase-free water 6.4 ul，cDNA template 2ul，配制成20ul 體系混合均勻，在儀器上保持95 ℃，1 min，95 ℃，10 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，94 ℃ 1 min 30 s，60 ℃ 1min，60 ℃→94 ℃，1.1 ℃/s升溫，從而獲得qPCR反應(yīng)結(jié)果。

結(jié)果

1.研究對象一般特征：兩組患者在年齡、絕經(jīng)時(shí)間、妊娠及分娩次數(shù)、體質(zhì)量指數(shù)等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.血漿中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達(dá)情況：Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的ELISA結(jié)果均顯示維族和漢族血漿中Collagen Ⅰ與Collagen Ⅲ表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，漢族女性血漿中Collagen I的表達(dá)量為(137.84±30.99)ng/mL，維吾爾族女性血漿中Collagen Ⅰ的表達(dá)量為(200.00±66.54)ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。漢族女性血漿中Collagen Ⅲ的表達(dá)量為(101.95±17.66)ng/mL，維吾爾族女性血漿中Collagen Ⅲ的表達(dá)量為(156.31±31.96)ng/mL。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ在維族血漿中的表達(dá)顯著高于漢族，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A、1B。

表1 各組患者一般信息

圖1 各組血漿中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達(dá)情況

3.維族及漢族陰道壁組織和骶主韌帶組織內(nèi)Collagen Ⅰ、Ⅲ的蛋白表達(dá)情況：

維族女性陰道壁組織中Collagen Ⅰ的蛋白表達(dá)量為(0.05±0.002)，漢族女性陰道壁組織中Collagen Ⅰ的蛋白表達(dá)量為(0.07±0.005)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

維族女性陰道壁組織中Collagen Ⅲ的蛋白表達(dá)量為(0.05±0.004)，漢族女性陰道壁組織中Collagen Ⅰ的蛋白表達(dá)量為(0.03±0.006)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。維族女性骶主韌帶組織中Collagen Ⅲ的蛋白表達(dá)量為(0.03±0.008)，漢族女性骶主韌帶組織中Collagen I的蛋白表達(dá)量為(0.04±0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

維族骶主韌帶組織和漢族骶主韌帶組織無明顯差異性，P>0.05，詳見圖2A-2B。

*P<0.05

4.Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA表達(dá)差異性：

骶主韌帶組織和陰道壁組織內(nèi)Collagen Ⅰ，Collagen Ⅲ的mRNA表達(dá)結(jié)果有差異。維族女性陰道壁組織中Collagen Ⅲ的mRNA表達(dá)量為(0.52±0.10)，漢族女性陰道壁組織中Collagen Ⅰ的mRNA表達(dá)量為(0.19±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

維族女性骶主韌帶組織中Collagen Ⅰ的mRNA表達(dá)量為(0.28±0.46)，漢族女性骶主韌帶組織中Collagen Ⅰ的mRNA表達(dá)量為(2.29±0.24)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

維族女性骶主韌帶組織中Collagen Ⅲ的mRNA表達(dá)量為(0.36±0.07)，漢族女性骶主韌帶組織中Collagen Ⅲ的mRNA表達(dá)量為(1.39±0.07)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

*P<0.05

討論

盆底支持組織主要由肌肉群和結(jié)締組織構(gòu)成，其支持和穩(wěn)定功能主要取決于細(xì)胞外基質(zhì)中不同類型纖維間的相互作用，主要包括膠原蛋白、蛋白聚糖、彈性蛋白、層黏連蛋白和纖連蛋白，其中膠原蛋白是主要蛋白質(zhì)成分，占全部蛋白25%以上[5]。膠原是有由3條a多膚鏈聯(lián)構(gòu)成三股螺旋結(jié)構(gòu)，而每條a鏈由近1 000個(gè)氨基酸組成，其長為300 mm。細(xì)胞外基質(zhì)大體可分為膠原蛋白、蛋白多糖、糖蛋白3大類。從而構(gòu)成可膠原穩(wěn)定的蛋白分前膠原是細(xì)胞內(nèi)合成后分泌到細(xì)胞外的，在細(xì)胞外形成膠原，進(jìn)而通自身募集形成膠原纖維以及纖維束，并決定了組織的一定形狀級生物行為。組織的韌性及強(qiáng)度與膠原的成熟性與化學(xué)特性有關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)數(shù)十種膠原，由不同基因編碼而成。不同的膠原蛋白有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)及免疫學(xué)特性，其中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白為主構(gòu)成盆底組織，Ⅰ型膠原直徑粗，硬度大，主要分布于皮膚、肌肉、骨骼、韌帶等組織，起支持作用；Ⅲ型膠原直徑細(xì)，彈性大，主要調(diào)控組織彈性[6-8]。

有研究表明，不同民族女性PFD的患病率具有差異性[9]，但尚無關(guān)于Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ在維吾爾族和漢族女性PFD之間的相關(guān)研究本次實(shí)驗(yàn)ELISA結(jié)果顯示，維族膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ型表達(dá)量明顯高于漢族。

本研究發(fā)現(xiàn)Collgen I和Collagen Ⅲ的基因和蛋白在組織中存在差異性，表明PFD主要發(fā)生點(diǎn)仍在組織內(nèi)，而非游離蛋白狀態(tài)決定。在基因水平上，維族患者陰道壁組織內(nèi)Collagen Ⅰ表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于漢族，維族骶主韌帶組織Collagen Ⅲ表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于漢族，說明在不同民族患者內(nèi)，維族陰道壁組織強(qiáng)度高于漢族，而主韌帶組織彈性小于漢族，表明在不同民族患者內(nèi)的盆底功能障礙性疾起因是不同的，漢族可能為陰道壁組織強(qiáng)度降低，維族為主韌帶組織彈性降低，均會(huì)引起組織彈性降低，脆性增加，易于斷裂，使盆底器組織對盆腔器官的支撐作用明顯減弱，從而導(dǎo)致PFD[10-11]。在蛋白水平上，維族患者陰道壁組織內(nèi)Collagen Ⅰ表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于漢族，與轉(zhuǎn)錄組水平一致；維族骶主韌帶組織Collagen Ⅲ表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于漢族，與轉(zhuǎn)錄組水平相反；故考慮維族骶主韌帶組織中前膠原蛋白可以過轉(zhuǎn)化為膠原蛋白III型，或者膠原酶活性降低或膠原酶含量低導(dǎo)致膠原蛋白降解減少所致[12]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展、基因遺傳及變異在盆底功能障礙性疾病中的作用日益受到醫(yī)學(xué)界研究人員的重視，本研究發(fā)現(xiàn)Collagen Ⅰ、Ⅲ的在維吾爾族和漢族之間的差異性可能是由基因易感性和外界環(huán)境問題的共同因素導(dǎo)致，國外一項(xiàng)PFD 家系研究顯示：126名家族性POP 患者中71%伴有SUI，54%伴有OAB，183名家族性 SUI患者中59 %合并POP，60%合并OAB，而101位家族性 OAB患者中 SUI 及 POP 的發(fā)生率分別為88%和66%，提示遺傳因素在 PFD發(fā)病過程中的作用不容忽視[13]。瑞典學(xué)者 Altman 等[14]在開展了一項(xiàng)大樣本量隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，同卵雙生子之間患病情況的相似度顯著高于異卵雙生子，提示遺傳效應(yīng)影響 SUI和 POP的發(fā)病; 進(jìn)一步分析顯示，遺傳效應(yīng)和特異環(huán)境因素對總變異的貢獻(xiàn)各占40%左右，非特異性的環(huán)境因素貢獻(xiàn)約20%的總變異，提示環(huán)境因素的影響在 SUI /POP 的發(fā)病中占主導(dǎo)作用。相關(guān)研究[15]表明膠原蛋白調(diào)控合成基因的基因多態(tài)性與PFD之間存在相關(guān)性，miR-196a-2、miR-146a、miR-149等的基因編碼區(qū)多態(tài)性差異即可影響膠原蛋白形成，導(dǎo)致不同民族人群PFD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)不同。同時(shí)新疆地區(qū)維吾爾族的生活方式、飲食習(xí)慣也會(huì)起到一定的影響作用。因此，也可能會(huì)造成膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ型的不同表達(dá)，本研究樣本量較少，需要今后進(jìn)一步研究更加明確。