Rudhira/BCAS3影響血管形成的機制及其與胚胎發(fā)育和臨床疾病的研究

師向榮 郝曉瑩 袁潔玲 高介芳

一、Rudhira/BCAS3的結(jié)構(gòu)和功能

人類乳腺癌擴增序列3(breast carcinoma amplified sequence 3，即BCAS3)最早發(fā)現(xiàn)于乳腺癌中，在其他腫瘤如腦腫瘤中也有表達，不具有組織特異性，是與小鼠Rudhira 98%相同的一種細胞骨架蛋白[1]，有學(xué)者先后使用多種生物信息學(xué)預(yù)測工具對Rudhira蛋白的結(jié)構(gòu)域或基序進行預(yù)測，包括：WD40結(jié)構(gòu)域、BCAS3結(jié)構(gòu)域、富含脯氨酸(P)、谷氨酰胺(E)、絲氨酸(S)、蘇氦酸(T)的PEST基序、SxIP基序和磷酸化位點，這些結(jié)構(gòu)域及基序是Rudhira蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵。其中，BCAS3結(jié)構(gòu)域是組成Rudhira蛋白的結(jié)構(gòu)域之一，其對于Rudhira發(fā)揮功能是充分必要的，如Rudhira蛋白的全長以及BCAS3結(jié)構(gòu)域可以有效地共免疫沉淀微管蛋白并通過結(jié)合微管蛋白發(fā)揮其功能。

1.人類BCAS3的結(jié)構(gòu)

BCAS3位于染色體17q23，全長600kb，含有24個外顯子，編碼913個氨基酸，最早發(fā)現(xiàn)BCAS3是在乳腺癌中，其命名也由此而來，BCAS3和BCAS4在乳腺癌中廣泛過表達且融合，融合斷裂點位于BCAS3基因的22號外顯子和23號外顯子之間[2]。BCAS3不僅在乳腺癌中的表達，也在腦腫瘤中表達[1]，不具有組織特異性。序列相似性分析顯示，在核苷酸或氨基酸水平上BCAS3基因沒有人類同源基因[2]，而與小鼠Rudhira基因有98%的同一性[1]。

2.小鼠Rudhira的結(jié)構(gòu)

小鼠Rudhira位于染色體11C，即鎂離子依賴的蛋白磷酸酶1D和T-box2轉(zhuǎn)錄因子之間，是編碼928個氨基酸的一種細胞骨架蛋白，小鼠轉(zhuǎn)錄組鑒定了該基因的全長cDNA和編碼序列，該cDNA是含有388個氨基酸(aa)的開放閱讀框(ORF)，沒有polyA尾[1]。Rudhira主要表達于內(nèi)皮細胞[3]，在多種腫瘤來源的細胞系也有表達，如乳腺癌MCF-7細胞和宮頸癌Hela細胞等[1]。

Siva[1]和Joshi[7]等人先后使用多種生物信息學(xué)預(yù)測工具對Rudhira蛋白的結(jié)構(gòu)域或基序進行預(yù)測，預(yù)測存在以下結(jié)構(gòu)域，包括一些翻譯后修飾：(1)WD40結(jié)構(gòu)域：主要功能是通過蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用組裝形成蛋白質(zhì)復(fù)合體來調(diào)控各種各樣的生物學(xué)功能，此外，WD40結(jié)構(gòu)域能夠組成β-螺旋槳結(jié)構(gòu)，Joshi等人[7]使用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測工具Phyre2在Rudhira蛋白的N-末端附近預(yù)測存在一個β-螺旋槳結(jié)構(gòu)，而結(jié)構(gòu)預(yù)測工具RaptorX則預(yù)測存在兩個β-螺旋槳結(jié)構(gòu)，其結(jié)果不一致，有待進一步研究；(2)BCAS3結(jié)構(gòu)域：Rudhira蛋白發(fā)揮功能的主要結(jié)構(gòu)功能區(qū)，例如Rudhira蛋白通過BCAS3結(jié)構(gòu)域與微管(microtubules，MT)和波形蛋白中間體細絲(vimentin intermediate filaments，IF)結(jié)合，并促進MT-IF交聯(lián)，進而調(diào)節(jié)細胞骨架結(jié)構(gòu)，維持細胞形態(tài)、促進細胞運動；(3)富含脯氨酸(P)、谷氨酰胺(E)、絲氨酸(S)、蘇氦酸(T)的PEST基序：參與蛋白質(zhì)降解，如PEST基序缺失，顯示出泛素蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解的易感性增加；(4)SxIP基序：含絲氨酸-任何氨基酸-異亮氨酸(I)- 脯氨酸的基序，介導(dǎo)Rudhira蛋白與末端結(jié)合蛋白EB1(一種微管正末端追蹤蛋白即+ TIPs，調(diào)節(jié)微管動態(tài)性)結(jié)合并定位到微管末端，調(diào)控微管的動態(tài)不穩(wěn)定性，進而參與微管介導(dǎo)的許多細胞活動，包括細胞極化、細胞運動、細胞有絲分裂等，如通過調(diào)控微管末端動態(tài)性促進細胞定向遷移；(5)磷酸化位點：Rudhira蛋白的磷酸化可能參與調(diào)節(jié)微管正末端蛋白(+ TIPs)的募集，進而調(diào)控微管動態(tài)不穩(wěn)定性，但具體研究尚缺。

3. 人類BCAS3和小鼠Rudhira之間的關(guān)系

人類BCAS3是與小鼠Rudhira 98%相同的一種細胞骨架蛋白[1]。BCAS3結(jié)構(gòu)域是組成Rudhira蛋白的結(jié)構(gòu)域之一。Joshi等人[7]研究發(fā)現(xiàn)僅去除Rudhira蛋白上的含BCAS3結(jié)構(gòu)域的片段，導(dǎo)致Rudhira蛋白功能喪失，表明Rudhira蛋白發(fā)揮功能需要BCAS3結(jié)構(gòu)域。此外，Rudhira蛋白含有多個波形蛋白結(jié)合區(qū)，但微管蛋白結(jié)合區(qū)主要存在于含BCAS3結(jié)構(gòu)域的片段中，Rudhira蛋白的全長以及BCAS3結(jié)構(gòu)域可以有效地共免疫沉淀微管蛋白，表明Rudhira蛋白的全長和BCAS3結(jié)構(gòu)域可以通過結(jié)合微管蛋白發(fā)揮其功能，BCAS3結(jié)構(gòu)域?qū)τ赗udhira發(fā)揮功能是充分必要的。

二、Rudhira/BCAS3功能和相關(guān)機制

1.Rudhira/BCAS3的功能

Rudhira是一種動態(tài)調(diào)節(jié)的分子，可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的遷移和發(fā)芽[3,6]。Rudhira的主要功能是由BCAS3結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)，與MT和波形蛋白中間體細絲(vimentin IF)相互作用，促進MT和Vimentin IF交聯(lián)，維持MT動態(tài)性并促進Vimentin IF延伸，指導(dǎo)MT依賴的黏著斑(focal adhesion，F(xiàn)A)解聚，以調(diào)節(jié)細胞骨架動態(tài)重組及FA的轉(zhuǎn)換，促進細胞遷移。

2.Rudhira/BCAS3和血管形成

血管形成包括細胞外基質(zhì)、細胞-細胞、細胞-基質(zhì)的局部重塑粘連，如細胞黏附、細胞外基質(zhì)重塑等，此外，細胞極性的建立、血管內(nèi)皮細胞遷移和內(nèi)皮細胞管狀結(jié)構(gòu)的形成都是血管形成中的關(guān)鍵步驟[3]。

近期Shetty等人[3]研究發(fā)現(xiàn)Rudhira在血管形成及其相關(guān)過程中起作用，包括血管內(nèi)皮細胞遷移、細胞黏附和細胞外基質(zhì)重塑等。Shetty等人[3]在敲除小鼠Rudhira基因(KD)研究中的轉(zhuǎn)錄組分析顯示Rudhira影響細胞黏附和細胞外基質(zhì)重塑，在體外細胞侵襲試驗測定中顯示敲低rudhira(KD)的內(nèi)皮細胞侵襲性下降，同一實驗中，rudhira KD使細胞外基質(zhì)如膠原蛋白基質(zhì)的細胞黏附性降低。在體外球狀體發(fā)芽血管生成測定中發(fā)現(xiàn)rudhira KD的內(nèi)皮細胞未能發(fā)芽，表明Rudhira是內(nèi)皮細胞發(fā)芽所必需的。這些都是血管形成的相關(guān)過程。

細胞極性建立和內(nèi)皮細胞遷移是血管形成的關(guān)鍵步驟。微管組織中心(MTOC)和高爾基體重定向是極化細胞的既定標志。Rudhira通過在內(nèi)皮細胞中建立細胞極性和誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞遷移而促進血管形成。Jain等人[6]研究發(fā)現(xiàn)Rudhira通過使MTOC和高爾基體重新定向而使細胞在傷口邊緣方向上極化，表明Rudhira在細胞遷移前建立細胞極性方面發(fā)揮著重要作用。在同一研究中，Jain等人通過遷移軌跡分析發(fā)現(xiàn)Rudhira敲低的細胞遷移受損，并且在刮擦后細胞移動得更慢且隨機地進入傷口邊緣，表明Rudhira影響細胞遷移過程中的速度和方向。Shetty等人[3]研究也表明敲除rudhira基因的卵黃囊細胞遷移率下降和細胞遷移的方向喪失。

內(nèi)皮細胞管狀結(jié)構(gòu)形成也是血管形成的關(guān)鍵步驟之一。Jain等人[6]通過體外血管生成實驗研究發(fā)現(xiàn)敲低內(nèi)皮細胞中Rudhira后，內(nèi)皮細胞成管能力下降，表明Rudhira在內(nèi)皮細胞管狀結(jié)構(gòu)形成中起重要作用。

3.Rudhira/BCAS3在控制細胞遷移過程中細胞骨架重塑的機制

細胞遷移過程中細胞骨架成分的相互作用是動態(tài)調(diào)節(jié)的，細胞骨架成分相互作用的調(diào)節(jié)可能在機體發(fā)育以及腫瘤血管生成中是重要的。Rudhira對于維持正常細胞骨架至關(guān)重要。Rudhira促進細胞骨架成分相互交聯(lián)，是維持MT動態(tài)不穩(wěn)定性和FA動力學(xué)所必需的。

(1)Rudhira/BCAS3與肌動蛋白

肌動蛋白絲，微管MT，中間絲(IF)和細胞骨架相關(guān)蛋白之間的緊密和復(fù)雜的相互作用導(dǎo)致細胞形態(tài)變化和黏著斑(FAs)動態(tài)重組，這對于定向細胞遷移是必需的。定向細胞遷移需要在前沿連續(xù)協(xié)調(diào)黏著斑FAs組裝和解聚，并在后部釋放附著物，F(xiàn)As組裝或解聚的異常對細胞遷移都是有害的。

Jain等人[6]使用雙順反子Rudhira過表達的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細胞(NIH 3T3細胞)作為實驗組，將Rudhira siRNA轉(zhuǎn)染的小鼠隱靜脈內(nèi)皮細胞系(SVEC)作為對照組，實驗組應(yīng)力纖維顯著減少，并且絲狀偽足延伸增加，結(jié)果表明Rudhira可以重組肌動蛋白，促進細胞遷移。

(2)Rudhira/BCAS3與MT和波形蛋白中間體細絲(IF)

MTs和Vimentin IFs在細胞中配合以進行有效遷移，雖然最初Vimentin IFs沿著MTs形成，但后來這些細絲為MT生長提供了模板[9]。此外，IF主要通過MT依賴性轉(zhuǎn)運和肌動蛋白依賴性流動，暗示細胞遷移過程中廣泛的細胞骨架交聯(lián)和交叉調(diào)控[10]。已有研究表明[8]，缺乏細胞骨架連接蛋白(plectin)的小鼠在出生后2-3天死亡，說明細胞骨架成分之間相互交聯(lián)對于胚胎發(fā)育的重要性。研究表明[7]，Rudhira通過其保守的BCAS3結(jié)構(gòu)域直接與內(nèi)皮細胞中MT和IF相互作用，促進MT-IF交聯(lián)，維持MT動態(tài)不穩(wěn)定性，促進細胞骨架重塑及FA轉(zhuǎn)換，進而促進細胞遷移。

為了探索Rudhira在細胞遷移中起作用的可能機制，Joshi等人[7]利用Rudhira敲低(KD)的小鼠隱靜脈內(nèi)皮細胞系和非沉默對照(NS)的免疫定位顯示，在Rudhira KD的內(nèi)皮細胞中MTs未對齊并且在內(nèi)皮細胞周邊處彎曲，而Vimentin IFs較少，占據(jù)內(nèi)皮細胞內(nèi)較小的區(qū)域并且不延伸，僅存在于內(nèi)皮細胞核周區(qū)域。Rudhira KD的內(nèi)皮細胞在細胞皮層有厚的肌動蛋白束，表明細胞和基質(zhì)黏附異常，進而導(dǎo)致異常的內(nèi)皮細胞遷移。表明Rudhira KD導(dǎo)致細胞骨架嚴重紊亂和內(nèi)皮細胞遷移異常。

(3)Rudhira/BCAS3與黏著斑(FA)

MT和F-肌動蛋白(即聚集的肌動蛋白)募集對FA組織和動力學(xué)至關(guān)重要[26]。FA組裝是肌動蛋白驅(qū)動的，F(xiàn)A解聚需要黏著斑激酶(FAK)磷酸化、MT和細胞動力蛋白2[27]的參與。Joshi等人[7]研究表明Rudhira在MT介導(dǎo)的FA解聚中起作用，在Rudhira KD細胞中免疫定位顯示FA大小增加，數(shù)量減少，表明FA動力學(xué)受損。這些數(shù)據(jù)證實了Rudhira在細胞骨架上具有主要功能，促進FA轉(zhuǎn)換和細胞遷移。

三、Rudhira/BCAS3和胚胎發(fā)育

胚胎發(fā)育過程中存在著大量的新血管生成和重塑。Siva等人[1]通過小鼠RNA原位雜交的免疫染色在小鼠胚胎期6.5天(Embryo 6.5)和E7.5天未檢測到Rudhira RNA和蛋白質(zhì)，在E8.5天，Rudhira RNA和蛋白質(zhì)在心臟區(qū)域低水平表達，在卵黃囊血島和卵黃囊中胚層強烈表達，在E9.5天和E10.5天，于頭部間充質(zhì)、體細胞中胚層、耳部囊泡、少數(shù)主要血管和少數(shù)血細胞中檢測到Rudhira RNA的表達。Shetty等人[3]研究了小鼠胚胎在可檢測到Rudhira基因之前(E7.5)和之后(E8.5、E9.5)Rudhira基因缺失對胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在可檢測到Rudhira基因之前與對照組相比胚胎發(fā)育無明顯影響，而在可檢測到Rudhira基因之后敲除小鼠胚胎Rudhira基因，E8.5天顯示出小鼠胚胎背主動脈的結(jié)構(gòu)異常，E9.5天顯示胚胎發(fā)育遲緩，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rudhira可影響胚胎發(fā)育的不同過程，表明Rudhira可能對胚胎的多個發(fā)育過程至關(guān)重要。

Shetty等人[3]用抗PECAM1抗體整體免疫染色分析了敲除所有細胞中Rudhira基因及僅敲除內(nèi)皮細胞Rudhira基因(Rudhira CKO)的胚胎，發(fā)現(xiàn)Rudhira CKO胚胎與敲除所有細胞Rudhira基因的胚胎有相似的表型，并且僅敲除內(nèi)皮細胞Rudhira基因后，Rudhira的RNA和蛋白質(zhì)水平顯著降低，均表明Rudhira主要表達于內(nèi)皮細胞中。在同一研究中，Shetty等人利用免疫染色、組織學(xué)分析以及形態(tài)學(xué)分析了敲除Rudhira基因的小鼠胚胎卵黃囊與胎盤的血管形成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rudhira對于卵黃囊和胎盤的血管網(wǎng)絡(luò)重塑是必不可少的。Rudhira影響胚胎血管形成，進而導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常甚至是胚胎死亡。

四、Rudhira / BCAS3與臨床疾病

目前一些研究顯示[1,5-6]，Rudhira/BCAS3高表達于乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、腦血管外皮細胞瘤和小腦成神經(jīng)管細胞瘤等腫瘤，認為Rudhira/BCAS3在控制癌細胞極性和促進腫瘤轉(zhuǎn)移中有潛在作用。除此之外，有研究表明[16，18，25]，BCAS3基因多態(tài)性與腎臟疾病易感性(如痛風(fēng))、原發(fā)性開角型青光眼、冠狀動脈疾病發(fā)生相關(guān)。

1.Rudhira / BCAS3與腫瘤

Rudhira/BCAS3在腫瘤來源的細胞系如HeLa、MCF-7和內(nèi)皮細胞系Py-4-1中表達，并且與乳腺癌進展有關(guān)[1,5]。Rudhira/BCAS3與轉(zhuǎn)移性乳腺癌有關(guān)[2,4]，并且與乳腺腫瘤的分級和增殖有關(guān)[5]。在不同類型的人腦腫瘤中發(fā)現(xiàn)了BCAS3的高表達，包括膠質(zhì)母細胞瘤、腦血管外皮細胞瘤和小腦成神經(jīng)管細胞瘤[4,22]。目前已有學(xué)者提出新的見解，認為Rudhira在控制癌細胞極性和促進腫瘤轉(zhuǎn)移中有潛在作用[6]。因此，Rudhira可能是控制血管疾病和侵入性腫瘤的潛在目標。

(1)Rudhira / BCAS3與乳腺癌

據(jù)Corrêa等人[20]研究，BCAS3在乳腺癌供體血漿中的表達水平高于健康供體，表明BCAS3蛋白質(zhì)可作為潛在的乳腺癌標記物。BCAS3基因在乳腺癌細胞系(主要是ER細胞系)和大約10%的原發(fā)性乳腺腫瘤中的擴增進一步表明BCAS3參與乳腺癌進展[2]。此外，原發(fā)性乳腺腫瘤中BCAS3的過度表達與腫瘤分級和增殖有關(guān)[5]。BCAS3的最后兩個外顯子可以轉(zhuǎn)移到乳腺癌中另一個常見擴增區(qū)域20q13，從而產(chǎn)生在MCF-7細胞中高度過表達的融合產(chǎn)物BCAS3-BCAS4[2]。在MCF-7細胞系中檢測到的融合產(chǎn)物BCAS3-BCAS4(乳腺癌擴增序列3/4)，其伴侶基因BCAS3和BCAS4在乳腺癌中廣泛過表達且融合[2]。有研究顯示[21]，BCAS3- BCAS4、MED13-BCAS3基因融合已被證明是乳腺癌發(fā)生的高風(fēng)險。

(2)Rudhira / BCAS3與腦腫瘤

Siva等人[1]前期在小鼠腦中發(fā)現(xiàn)多種Rudhira剪接變體，遂在后期[4]進一步研究了人體大腦組織，發(fā)現(xiàn)在不同類型的人腦腫瘤中檢測出BCAS3大量表達，包括膠質(zhì)母細胞瘤、腦血管外皮細胞瘤和小腦成神經(jīng)管細胞瘤[22]。

分子途徑的異常調(diào)節(jié)可導(dǎo)致組織異常生長甚至是惡性腫瘤的發(fā)生[22]。一些對于生長發(fā)育起重要作用的關(guān)鍵分子，其異常表達可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[23,24]。Rudhira / BCAS3在III級膠質(zhì)母細胞瘤和其他癌癥中的異常表達使其成為治療這些疾病的主要靶點。Rudhira / BCAS3在腦腫瘤的異常高表達可能作為診斷腦腫瘤的標志物。

2.BCAS3基因多態(tài)性與非腫瘤疾病

(1)BCAS3基因多態(tài)性與腎臟疾病易感性

Okada等人[11]研究了一項與腎功能相關(guān)(包括血尿素氮、尿酸和血清肌酐的濃度，以及基于血清肌酐水平估計的腎小球濾過率)的全基因組關(guān)聯(lián)研究的薈萃分析，確定了17個與腎功能相關(guān)的新的基因。其中，BCAS3基因與腎功能顯著關(guān)聯(lián)。Franceschini等人[12]分析了美國印第安人與腎功能相關(guān)遺傳研究的數(shù)據(jù)，在薈萃分析中，證實BCAS3的內(nèi)含子變體與尿白蛋白與肌酐比率顯著相關(guān)。Lee等人[13]應(yīng)用了與韓國人腎臟疾病相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)研究，通過比較與血清肌酐水平和腎小球濾過率(GFR)相關(guān)的遺傳基因，發(fā)現(xiàn)BCAS3中的單核苷酸基因多態(tài)性(SNP)rs9895661同時與腎病的血清肌酐濃度和GFR相關(guān)。有研究顯示[14,15]，BCAS3的三個SNP(rs9895661，rs9905274，rs11653176)與漢族男性人群的痛風(fēng)有關(guān)。Sakiyama等人[16]研究也發(fā)現(xiàn)BCAS3中SNP rs11653176與痛風(fēng)相關(guān)聯(lián)，此外，BCAS3的SNP rs11653176的風(fēng)險等位基因C可能增加腎臟尿酸鹽再吸收的風(fēng)險，導(dǎo)致血清尿酸(SUA)水平和痛風(fēng)的風(fēng)險增加。K?ttgen等人[17]發(fā)現(xiàn)BCAS3的另一個內(nèi)含子SNP rs2079742的表達與SUA水平有關(guān)。

(2)BCAS3基因多態(tài)性與原發(fā)型開角型青光眼

原發(fā)型開角型青光眼多與遺傳因素相關(guān)，Ramdas等人[25]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，確定了染色體17q23上的BCAS3基因?qū)Υ怪北P比(視神經(jīng)乳頭中央的凹陷即杯區(qū)，視神經(jīng)乳頭即視盤，二者垂直徑之比即垂直杯盤比)有影響，垂直杯盤比的改變參與開角型青光眼的發(fā)生。Springelkamp等人[19]進一步研究表明，BCAS3(SNP rs11651885)與視神經(jīng)乳頭杯區(qū)相關(guān)，參與原發(fā)性開角型青光眼的發(fā)生。

(3)BCAS3基因多態(tài)性與冠狀動脈疾病

Nikpay等人[18]研究顯示BCAS3中的前導(dǎo)內(nèi)含子SNP rs7212798與冠狀動脈疾病強烈關(guān)聯(lián)。

五、總結(jié)與展望

Rudhira / BCAS3高表達于血管生成旺盛的內(nèi)皮細胞，血管生成旺盛的內(nèi)皮細胞較多存在于胚胎血管以及腫瘤血管，Rudhira / BCAS3通過促進細胞骨架成分相互交聯(lián)，進而促進血管形成，已證實Rudhira / BCAS3缺失的小鼠胚胎血管形成異常，進而導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常甚至是胚胎死亡。目前關(guān)于Rudhira / BCAS3與胚胎血管形成的研究主要在動物胚胎上，相關(guān)人體研究尚缺。而Rudhira / BCAS3在乳腺癌及腦腫瘤中的高表達，是否由于高表達的Rudhira / BCAS3促進血管新生而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，機制尚不清楚，有待進一步研究。中國人群BCAS3基因多態(tài)性與腎臟等疾病易感性的相關(guān)性研究，有助于發(fā)現(xiàn)與腎臟等疾病易感性相關(guān)的危險基因型，并有望作為分子標志物用于篩選腎臟等疾病的高危人群或易感個體。