植物乳桿菌發(fā)酵草莓果漿工藝優(yōu)化及抗氧化特性變化

盧世鳳，尹琳琳，汪暄妍，茆麗萍

（淮南師范學(xué)院 生物工程學(xué)院，安徽 淮南 232038）

大多數(shù)乳酸菌為人體益生菌，在腸道定植和生長繁殖可抑制致病菌，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡，具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、提高機(jī)體免疫力、降低膽固醇及預(yù)防癌癥等生理功能［1］。而作為人體補(bǔ)充乳酸菌主要來源的發(fā)酵酸乳，被乳糖不耐受、高膽固醇、易致敏及素食主義等消費(fèi)者群體所難以接受［2］，因此，嘗試以果蔬為基質(zhì)進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵已引起人們的廣泛關(guān)注。植物乳桿菌是一種廣泛用于果蔬汁發(fā)酵的乳酸菌，大量研究證明其在多種果汁中具有較強(qiáng)的發(fā)酵能力，表現(xiàn)出良好的普適性。植物乳桿菌發(fā)酵還可促進(jìn)果蔬汁中酚類等生物活性物質(zhì)的溶出，能顯著提升發(fā)酵果蔬汁的抗氧化能力［3］。植物乳桿菌發(fā)酵對果蔬汁色澤的劣變有積極的抑制作用，感官評價明顯向好［4］。

草莓屬小漿果類，酸甜可口，色澤艷麗，多以鮮食為主，但其果質(zhì)嬌嫩，運(yùn)輸困難，常溫下僅可保存1～2 d。速凍草莓、草莓果醬、草莓汁等初加工產(chǎn)品，雖然可減少鮮果腐爛浪費(fèi)，但附加值較低。草莓中富含糖類、有機(jī)酸、氨基酸等營養(yǎng)成分，以及多酚、VC等天然抗氧化物質(zhì)，使其可為乳酸菌發(fā)酵提供優(yōu)良基質(zhì)［5］。利用酵素、植物乳桿菌等發(fā)酵后，發(fā)現(xiàn)草莓汁的抗氧化性提升顯著，總酚、檸檬酸、L-蘋果酸、醋酸和乳酸等代謝產(chǎn)物含量均有提升［6-7］。已有研究主要以草莓清汁為發(fā)酵基質(zhì)，對乳酸菌發(fā)酵草莓果漿的相關(guān)研究鮮見報道。草莓果漿保留了草莓全部的營養(yǎng)物質(zhì)，理論上更具發(fā)酵優(yōu)勢。有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在蘋果果漿中發(fā)酵效果顯著優(yōu)于蘋果清汁，且發(fā)酵后新增大量揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)［8］。而對乳酸菌發(fā)酵果漿前后主要理化特性及抗氧化特性的研究較少。因此，本文利用植物乳桿菌發(fā)酵草莓果漿，以活菌數(shù)和感官評分為指標(biāo)，優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝，并分析發(fā)酵前后草莓果漿主要理化品質(zhì)及抗氧化特性變化，為草莓精深加工提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草莓購自淮南市水果批發(fā)市場；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）由淮南師范學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)中心提供；抗壞血酸，北京嘉康源科技有限公司；果膠酶，河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；福林酚試劑（生物技術(shù)級），國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；MRS（Man rogosa sharp）肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、DPPH（1，1-Diphenyl-2-trinitro-phenylhydrazine）自由基試劑盒，南京建成生物工程研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

HR2062 PHILIPS攪拌機(jī)，飛利浦電子有限公司；ZSBB-724恒溫水槽，上海智城分析儀器制造有限公司；LDZM-80L-||型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHS-3C pH計，上海越平科學(xué)儀器制造有限公司；D-7型紫外可見分光光度計，南京菲勒儀器有限公司；Z-216-M型小型臺式離心機(jī)，德國HERMLE；ZXSD-A1090型生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 草莓果漿的制備 將新鮮草莓去蒂后，用滅菌冷卻后去離子水沖洗，按瀝水后草莓質(zhì)量的0.1%添加抗壞血酸，于勻漿機(jī)打漿，草莓漿轉(zhuǎn)移至大燒杯，按漿液質(zhì)量0.05%的比例添加果膠酶，攪拌均勻，用8層紗布封口，置于恒溫箱中45℃，保溫60 min。冷卻后用碳酸氫鈉調(diào)整果漿的pH值至5.5（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌在該酸度條件下發(fā)酵效果良好），于恒溫水浴鍋中80℃，保溫20 min以滅酶和殺菌，冷卻后于-20℃冷凍，備用。1.3.2 草莓果漿發(fā)酵 挑取植物乳桿菌試管斜面菌落，于MRS瓊脂平板劃線，37℃培養(yǎng)48 h，重復(fù)兩次。挑取平板菌落1環(huán)至50 mL液體MRS中，37℃培養(yǎng)24 h，作草莓果漿發(fā)酵種子液用。調(diào)整不同接種量接種于4℃融化的草莓果漿，在相應(yīng)預(yù)設(shè)條件下靜置發(fā)酵。

1.3.3 草莓果漿發(fā)酵單因素及正交優(yōu)化試驗(yàn)以發(fā)酵草莓果漿中植物乳桿菌活菌數(shù)和感官評分為評價指標(biāo)，分別固定發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時間18 h、接種量2%，考察發(fā)酵溫度（28、31、34、37、40℃）、發(fā)酵時間（6、10、14、18、22、26 h）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）三個因素變量對草莓果漿的發(fā)酵效果影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵溫度31、34、37℃，發(fā)酵時間14、18、22 h和接種量2%、3%、4%，采用L9（34）正交表，進(jìn)行植物乳桿菌發(fā)酵草莓果漿正交優(yōu)化試驗(yàn)，因素水平表如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L9（34）Tab.1 Factor and level table of orthogonal experiment L9（34）

1.3.4 植物乳桿菌活菌數(shù)測定 根據(jù)GB 4789.35-2016［9］對草莓果漿中乳酸菌活菌數(shù)進(jìn)行檢測。預(yù)估草莓果漿中乳酸菌總數(shù)，進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇2～3個連續(xù)的適宜稀釋度，吸取1 mL樣品勻液于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平行試樣。倒入約15 mL冷卻至50℃左右的MRS瓊脂培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿混合均勻，冷卻后倒置于（36±1）℃培養(yǎng)（72±2）h，進(jìn)行平板菌落計數(shù)。

1.3.5 發(fā)酵草莓果漿感官評價 選15名有食品質(zhì)量與安全專業(yè)背景的老師及學(xué)生，對發(fā)酵草莓果漿從色澤、風(fēng)味、組織狀態(tài)和口感幾個方面，根據(jù)給定評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定打分，具體評分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 植物乳桿菌發(fā)酵草莓果漿感官評分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Sensory evaluation criteria of strawberry pulp fermented by Lactobacillus plantarum

1.3.6 理化指標(biāo)測定 總酸（以乳酸計）參照GB/T 12456-2008［10］中電位滴定法測定；總糖參考文獻(xiàn)［11］的方法測定；可溶性固形物采用手持式折光儀法測定；色差和褐變度參照文獻(xiàn)［12］的方法測定；總酚采用福林酚比色法［13］測定，總酚含量以一水沒食子酸當(dāng)量（Gallic acid equivalent，GAE）計，即mg GAE/mL，一水沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為0、1、2、3、4、5、6 mg/mL）制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.133 3x+0.001 5，R2=0.999；總黃酮采用Na-NO2-Al（NO）3-NaOH比色法測定［14］，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL）制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=7.421 2x+0.033 2，R2=0.991。

1.3.7 抗氧化特性測定 DPPH自由基清除活性采用DPPH自由基清除能力試劑盒法測定。首先用甲醇分別配制5、10、15、20、25μg/mL的Trolox標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，然后參照試劑盒程序添加反應(yīng)體系，混勻后室溫靜置30 min，517 nm波長下比色，1 cm光徑，無水乙醇調(diào)零，測定各管吸光度并記錄數(shù)據(jù)。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，自由基清除率作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=3.1961x+0.941，R2=0.998），計算草莓果漿DPPH自由基清除率。

總抗氧化能力采用總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒法測定，每個樣品需要做兩支試管，分別為測試管和對照管，向兩管中加入1 mL試劑1，加入0.1 mL待測樣品在測試管中，分別向兩管中加入2 mL試劑2和0.5 mL試劑3應(yīng)用液，混勻溶液之后37℃水浴30 min，水浴結(jié)束后分別向測定管和對照管中加入0.1 mL試劑4，在對照管中加入0.1 mL樣品，最后混勻靜置10 min，用蒸餾水作為空白管，520 nm波長處測定樣品吸光度（A），記錄數(shù)據(jù)并計算。在37℃時，每分鐘每mL樣品使反應(yīng)體系的吸光度（A）每增加0.01時，為一個總抗氧化能力單位（U）。

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行顯著性分析。所有指標(biāo)測定均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌發(fā)酵草莓果漿單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對草莓果漿活菌數(shù)和感官評分的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。隨著發(fā)酵溫度的升高，草莓果漿中植物乳桿菌活菌數(shù)和感官評分均為先升高后降低。其中，活菌數(shù)在37℃時最高，達(dá)8.93 lg（CFU/mL）；感官評分在34℃時最高。溫度不適宜時不但抑制該菌生長，同時也造成發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)下降。結(jié)合兩者整體變化趨勢，選取31、34、37℃進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖1 發(fā)酵溫度對草莓果漿活菌數(shù)和感官評分的影響Fig.1 Effects of fermentation temperature on viable count and sensory score of strawberry pulp

2.1.2 發(fā)酵時間對草莓果漿活菌數(shù)和感官評分的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。隨著發(fā)酵時間的延長，草莓果漿中植物乳桿菌活菌數(shù)呈上升趨勢，在6～18 h區(qū)間，活菌數(shù)增速較快，18 h后增加緩慢；感官評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在18 h時最高。發(fā)酵時間過低，活菌數(shù)不足，未呈現(xiàn)明顯發(fā)酵味，風(fēng)味單一；發(fā)酵時間高于18 h后，活菌數(shù)高，乳酸積累過多不但會抑制植物乳桿菌生長，還會使發(fā)酵草莓果漿酸味偏重。綜合考慮，選取14、18、22 h進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖2 發(fā)酵時間度對草莓果漿活菌數(shù)和感官評分的影響Fig.2 Effects of fermentation time on viable count and sensory score of strawberry pulp

2.1.3 接種量對草莓果漿活菌數(shù)和感官評分的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。在接種量1%～5%范圍內(nèi)，草莓果漿中植物乳桿菌活菌數(shù)呈持續(xù)增加趨勢，但在接種量高于3%時，活菌數(shù)增加緩慢。這表明接種量過低，植物乳桿菌生長過慢；接種量過高時，菌體生長快，產(chǎn)乳酸高，會抑制菌體繼續(xù)生長。在此接種量范圍，發(fā)酵草莓果漿的感官評分呈先上升后下降的趨勢。說明接種量過低時，菌體生長能力弱，可能還會污染雜菌，使草莓果漿感官品質(zhì)下降，而接種量高時，菌體過快繁殖，乳酸短時積累高，會出現(xiàn)菌體活性衰退、自溶等現(xiàn)象，影響發(fā)酵果漿品質(zhì)。因此，綜合考慮，選取接種量2%、3%、4%進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖3 接種量對草莓果漿活菌數(shù)和感官評分的影響Fig.3 Effects of inoculum size on viable count and sensory score of strawberry pulp

2.2 植物乳桿菌發(fā)酵草莓果漿正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在正交實(shí)驗(yàn)中，對植物乳桿菌發(fā)酵草莓果漿中活菌數(shù)和感官評分進(jìn)行雙指標(biāo)極差分析和方差分析，結(jié)果見表3和表4。對發(fā)酵草莓果漿活菌數(shù)影響的主次順序?yàn)椋篈＞C＞B，即發(fā)酵溫度影響最大，發(fā)酵時間次之，接種量影響最小；對發(fā)酵草莓果漿感官評分影響的次序?yàn)椋篊＞B＞A，即發(fā)酵時間影響最大，接種量次之，溫度最小。

表3 植物乳桿菌發(fā)酵草莓果漿正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析Tab.3 Orthogonal experiment results and range analysis of strawberry pulp fermented by Lactobacillus plantarum

表4 植物乳桿菌發(fā)酵草莓果漿正交實(shí)驗(yàn)方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal experiments of Lactobacillus plantarum fermented strawberry pulp

方差分析結(jié)果表明，發(fā)酵溫度對活菌數(shù)影響顯著（P＜0.05），發(fā)酵時間對感官評分影響顯著（P＜0.05），接種量對活菌數(shù)和感官評分影響均不顯著。選擇最優(yōu)組合為A3B2C3，即發(fā)酵溫度為37℃，接種量為3%，發(fā)酵時間為22 h。由于該組合不在正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計中，因此對草莓果漿在該組合條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示發(fā)酵草莓果漿中活菌數(shù)為8.83 lg（CFU/mL），感官評分為91分，色澤鮮麗，草莓果香和發(fā)酵香味相宜。

2.3 植物乳桿菌發(fā)酵前后草莓果漿色度變化

草莓富含豐富的花色苷，賦予其誘人鮮紅色，草莓的色澤穩(wěn)定性是其加工制品中重要評價指標(biāo)。表5為植物乳桿菌發(fā)酵前后草莓果漿的色度和褐變度檢測結(jié)果。草莓果漿經(jīng)發(fā)酵后，紅綠度值降低，紅度有一定下降，但不顯著；黃藍(lán)度值增大，黃度呈顯著增加；褐變度和亮度均無顯著變化。說明植物乳桿菌發(fā)酵草莓果漿對其色澤有所影響，但影響程度較小。無明顯褐變現(xiàn)象，因?yàn)榘l(fā)酵過程中積累的乳酸等能夠抑制褐變［15］。

表5 植物乳桿菌發(fā)酵前后草莓果漿色度變化Tab.5 Changes in chromaticity of strawberry pulp before and after fermentation with Lactobacillus plantarum

2.4 植物乳桿菌發(fā)酵前后草莓果漿主要理化指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。植物乳桿菌發(fā)酵草莓果漿的總酸（以乳酸計）含量是未發(fā)酵草莓果漿的2.5倍，pH值由5.15降至3.65。草莓果漿中約50%的糖類物質(zhì)被植物乳桿菌消耗，積累了大量酸類物質(zhì)，使果漿pH值顯著下降，呈現(xiàn)出明顯的發(fā)酵酸味。因?yàn)槿樗峋l(fā)酵果汁時蔗糖和果糖被消耗，乳酸含量顯著增加，而檸檬酸、酒石酸等有機(jī)酸降低［6］。

表6 植物乳桿菌發(fā)酵前后草莓果漿主要理化指標(biāo)變化Tab.6 Changes of main physical and chemical indexes of strawberry pulp before and after fermentation with Lactobacillus plantarum

雖然總糖含量下降顯著，但發(fā)酵草莓果漿的可溶性固形物無明顯變化，因?yàn)榘l(fā)酵果漿中酸、酚類等物質(zhì)的增加和溶出會彌補(bǔ)可溶性糖類的消耗［16］。發(fā)酵后草莓果漿中的總酚和總黃酮含量均顯著升高，一方面是草莓果漿經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后多酚類物質(zhì)（大多數(shù)黃酮類物質(zhì)屬于多酚類）溶出，另一方面該菌在生長代謝過程中利用果漿中的其他物質(zhì)合成或轉(zhuǎn)化成多酚類物質(zhì)所致［7］。

2.5 植物乳桿菌發(fā)酵前后草莓果漿抗氧化特性變化

通過對總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力的測定分析草莓果漿發(fā)酵前后抗氧化能力的變化，結(jié)果見圖4。草莓果漿經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后，總抗氧化能力為未發(fā)酵組的2.93倍，DPPH自由基清除能力為未發(fā)酵組的1.75倍，與總酚、總黃酮及總酸有的變化趨勢相近。這說明植物乳桿菌發(fā)酵顯著提高草莓果漿的抗氧化能力，且抗氧化能力的提升與活性物質(zhì)總酚、總黃酮等物質(zhì)增加有關(guān)。這與乳酸菌發(fā)酵蘋果汁［7］、藍(lán)莓汁［1］等多種果汁研究結(jié)果一致。乳酸菌可在發(fā)酵過程中產(chǎn)生蛋白酶、葡萄糖苷酶等酶，促進(jìn)全果汁中與蛋白質(zhì)、膳食纖維等大分子物質(zhì)結(jié)合態(tài)的酚類物質(zhì)游離出來，乳酸菌通過產(chǎn)生酚酸脫羧酶、糖基水解酶或酯酶將酚類化合物轉(zhuǎn)化為生物活性更高的衍生物［17］。

圖4 植物乳桿菌發(fā)酵前后草莓果漿抗氧化特性變化Fig.4 Changes of antioxidant properties of strawberry pulp before and after fermentation with Lactobacillus plantarum

3 結(jié)論

利用在果蔬汁乳酸菌發(fā)酵中應(yīng)用較為廣泛的植物乳桿菌發(fā)酵草莓果漿，以活菌數(shù)和感官評分為評價指標(biāo)，通過單因素和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其最佳發(fā)酵溫度為37℃，接種量為3%，發(fā)酵時間為22 h，該條件下草莓果漿中活菌數(shù)為8.83 lg（CFU/mL），感官評分可達(dá)91分。發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對活菌數(shù)和感官評分均有顯著性影響，接種量對兩者影響均不顯著。與未發(fā)酵草莓果漿相比，發(fā)酵后其色澤穩(wěn)定，無明顯褐變現(xiàn)象，pH值和總糖含量顯著下降，可溶性固形物無顯著變化，總酸、總酚和總黃酮含量均顯著增加。發(fā)酵草莓果漿的總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力分別提升為未發(fā)酵組的2.93倍和1.75倍，這表明草莓果漿基質(zhì)適宜植物乳桿菌生長，且對草莓果漿的品質(zhì)具有明顯提升作用。未來還需對發(fā)酵過程中酶活性、糖類、有機(jī)酸及多酚類等活性物質(zhì)的代謝過程進(jìn)行深入研究。