尿蛋白/肌酐比值、堿性磷酸酶及微小核糖核酸92a與2型糖尿病合并骨量減少的相關性

鄧瓊瓊，趙瑞

(河南科技大學第一附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河南 洛陽 471000)

糖尿病是一組以血糖升高為主要表現(xiàn)的慢性代謝性疾病，其中以2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)占比最大，達90%以上。T2DM持續(xù)進展可導致多種代謝異常，不僅有糖、蛋白質(zhì)、脂肪代謝紊亂，還包括鈣代謝負平衡和骨代謝異常。相關研究報道，糖尿病患者中有20%～60%的患者并發(fā)骨質(zhì)疏松，屬于骨折高風險人群[1]。糖尿病性骨質(zhì)疏松癥已逐漸成為影響患者生存質(zhì)量的重要原因之一，其較高的致殘率已引起人們的重視。糖尿病性骨質(zhì)疏松癥早期無特異性表現(xiàn)，較難發(fā)現(xiàn)，常因骨折就診而被明確診斷。因此，找到有效的生物學指標對T2DM患者開展骨質(zhì)疏松篩查和骨折的風險評估，并及時對高風險的患者進行干預治療，對于降低糖尿病性骨折風險有重要意義。尿蛋白/肌酐比值(urinary albumin/creatinine ratio，UACR)是用于監(jiān)測尿蛋白排出情況的一種可靠方法，有研究發(fā)現(xiàn)，在UACR≥30的T2DM患者中骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生風險顯著增加，因此認為UACR水平與T2DM患者骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生存在一定關系[2]，但類似研究較少。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是一組具有特異性的磷酸酯酶，在人肝、骨、腎、小腸、乳腺等組織中有較高的分布。研究表明，ALP與成骨細胞的早期分化密切相關，在成骨細胞分化早期ALP處于較高水平[3]。有研究指出，微小核糖核酸92a(microribonucleic acid 92a，miRNA-92a)在骨生成和吸收中扮演了重要角色，在T2DM并發(fā)骨質(zhì)疏松患者中存在明顯異常表達[4]。本研究在既往研究的基礎上，同時探討UACR、ALP及miRNA-92a與T2DM合并骨量減少的相關性，為臨床T2DM患者骨量下降風險的早期評估和篩查提供方法和更豐富的理論依據(jù)。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象選擇2019年10月至2020年12月在河南科技大學第一附屬醫(yī)院就診的92例T2DM患者，依據(jù)雙能X線骨密度檢測儀測定結(jié)果將患者分為骨量正常組(n=37)和骨量減少組(n=55)。納入標準：(1)參照《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[5]及《中國人骨質(zhì)疏松癥診斷標準專家共識(2014)版》[6]的相關診斷標準，經(jīng)本院診斷為T2DM合并骨量減少；(2)接受雙能X線骨密度檢測確診。排除標準：(1)合并其他影響骨代謝的疾病如惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、類風濕關節(jié)炎、甲狀腺及甲狀旁腺功能異常、卵巢功能異?；蚯谐?；(2)既往有骨折病史(包括創(chuàng)傷性和病理性骨折)；(3)2 a內(nèi)或目前正在使用對骨代謝有影響的藥物；(4)有肢體運動障礙致使長期臥床。

1.2 檢測方法

1.2.1骨密度測定 采用徐州品源電子科技有限公司的雙能X線骨密度儀(型號Dexa Pro-I)對患者髖部和腰椎進行骨密度測量，以2個部位最低T值計。T>-1.0 SD為骨量正常，T≤-1.0 SD為骨量減少。根據(jù)骨量減少的程度，將-1.0 SD≥T>-1.5 SD劃分為輕度骨量下降，-2.5 SD≤T≤-1.5 SD劃分為中度骨量下降，T<-2.5 SD劃分為重度骨量下降。

1.2.2UACR測定 患者于入院第2天晨留取清潔中段尿10 mL，并送至檢驗科進行離心處理(5 000 r·min-1，離心8 min)，留取上層清液備檢，采用比濁法測定尿蛋白，采用比色法測定尿肌酐，試劑盒均由科艾博生物科技有限公司提供，根據(jù)尿蛋白和尿肌酐值測算UACR值。

1.2.3血清ALP、miRNA-92a測定 采集患者入院第2天晨空腹靜脈血10 mL，并送至檢驗科進行離心處理。(1)分離5 mL靜脈血以3 000 r·min-1離心10 min，得到血清并采用免疫比濁法檢測ALP水平，試劑盒由科艾博生物科技有限公司提供。(2)分離5 mL靜脈血在常溫以15 000 r·min-1離心5 min，收集上層血清后在4 ℃環(huán)境下進行第2次離心處理，以12 000 r·min-1離心6 min，取得血清置于-80 ℃環(huán)境中保存?zhèn)錂z。先對血清樣本中總RNA進行提取(提取試劑為TRIzol)，在總RNA中取5 μL RNA進行凝膠電泳(凝膠材料為瓊脂糖)純化，然后實施逆轉(zhuǎn)錄操作后得到cDNA(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供者為德國ThermoFisher公司提供，并嚴格按期說明書步驟進行)，內(nèi)參為β-actin。對cDNA進行實時熒光定量PCR，反應條件為94 ℃預變性10 min，94 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共循環(huán)35次，引物序列由德國ThermoFisher公司合成，計算miRNA-92a的相對表達量(計算方法為2-ΔΔCt)。

2 結(jié)果

2.1 臨床基礎資料兩組患者臨床基礎資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者臨床基礎資料比較

2.2 UACR、ALP及miRNA-92a水平骨量減少T2DM組患者UACR、ALP及miRNA-92a水平高于骨量正常T2DM組(P<0.05)。見表2。

表2 骨量減少T2DM組與骨量正常T2DM組患者UACR、ALP及miRNA-92a水平比較

2.3 不同程度骨量減少T2MD患者UACR、ALP及miRNA-92a水平重度骨量下降組患者UACR、ALP及miRNA-92a水平高于中度骨量下降組和輕度骨量下降組，中度骨量下降組患者UACR、ALP及miRNA-92a水平高于輕度骨量下降組(P<0.05)。見表3。

表3 不同程度骨量減少T2MD患者UACR、ALP及miRNA-92a水平比較

2.4 UACR、ALP及miRNA-92a與T2DM患者骨量減少相關性分析Pearson相關性分析結(jié)果顯示，UACR、ALP及miRNA-92a與T2DM患者骨量減少程度呈正相關(r=0.652，P<0.001；r=0.596，P<0.001；r=0.369，P<0.001)。見圖1。

圖1 UACR、ALP及miRNA-92a相關性分析

3 討論

骨代謝異常是糖尿病較常見的并發(fā)癥，是導致糖尿病患者骨質(zhì)疏松和骨折風險增大的主要因素。隨著我國生活水平的提升，T2DM呈明顯上升趨勢，T2DM合并骨質(zhì)疏松病例數(shù)明顯增多。相關調(diào)查顯示，T2DM患者骨質(zhì)疏松的綜合發(fā)病率高達37.8%，并且隨著年齡的增長而增加(60歲以上40.1%，60歲以下26.5%)[7]。及早發(fā)現(xiàn)和控制T2DM患者骨代謝問題，在減少T2DM患者骨折風險和改善患者生存質(zhì)量中具有重要意義。迄今，學者們公認1型糖尿病患者容易發(fā)生骨量減少，但T2DM患者骨密度增高、正常和降低3種情況均有報道，但骨折發(fā)生率增高已被證實[8]。T2DM患者骨密度存在爭議可能與樣本量和研究對象存在個體差異等因素有關。本研究納入的92例T2DM患者中55例患者存在骨量減少，37例T2DM患者骨量正常。本研究結(jié)果顯示，骨量減少T2DM組患者UACR、ALP及miRNA-92a水平高于骨量正常T2DM組，提示UACR、ALP及miRNA-92a可能與T2DM患者骨量存在一定關系。

UACR是臨床用于監(jiān)測尿蛋白排出情況的一種可靠方法，可一定程度反映T2DM患者腎功能。有研究發(fā)現(xiàn)，UACR≥30 mg·g-1的糖尿病患者其骨質(zhì)疏松發(fā)生率高于UACR<30 mg·g-1的糖尿病患者[9]。本研究結(jié)果顯示，骨量減少T2DM組患者UACR水平高于骨量正常T2DM組，與上述結(jié)果相符。原因可能為：(1)大量蛋白從尿液丟失，尿鈣、磷排出增多，骨質(zhì)下降；(2)T2DM患者出現(xiàn)大量蛋白尿，腎功能嚴重損害，機體1α-羥化酶活性低導致維生素D合成減少，進一步引發(fā)成骨細胞數(shù)量及活性下降；(3)T2DM患者腎功能損害，鈣、磷代謝穩(wěn)態(tài)被打破，甲狀旁腺增生，糖尿病腎病患者存在繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進，甲狀旁腺素分泌增多，使得骨吸收增加，加重骨量丟失。T2DM患者合并骨量減少使得病情更加復雜，本研究還發(fā)現(xiàn)UACR水平與患者骨量減少程度呈正相關，T2DM患者可在醫(yī)生指導下定期做UACR檢查，及時發(fā)現(xiàn)骨代謝異常，避免向骨性疾病發(fā)展。

ALP是一組能催化核酸分子脫掉5’磷酸基團的同工酶。大量研究已證實，ALP是骨質(zhì)代謝的重要參與者，其與骨形成及骨礦化有著密切聯(lián)系，目前已被公認為是評價骨質(zhì)形成和轉(zhuǎn)換重要生化指標之一[10-11]。研究表明，成骨細胞表面存在胰島素受體，胰島素對成骨細胞的生理功能發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用，T2DM患者存在體內(nèi)胰島素相對缺乏，影響成骨細胞的功能和活性[12]。成骨細胞是ALP的主要來源，成骨作用及成骨細胞數(shù)量及活性對機體ALP的水平有著重要影響。本研究結(jié)果顯示，骨量減少T2DM組患者ALP水平高于骨量正常T2DM組，且與患者骨量減少程度呈正相關，提示ALP與T2DM患者骨量減少存在相關性。ALP在組織分布廣泛，除了骨性組織之外，在肝、腸、腎等組織也有較高分布，機體血清ALP水平還受其他組織影響，其靈敏度和特異性不具有優(yōu)勢。因此，ALP可以粗淺地反映T2DM患者骨代謝水平。

miRNA有17～25個核苷酸，對基因的表達起重要調(diào)控作用。研究表明，miRNA參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化及凋亡，與多種骨性疾病如骨質(zhì)疏松、軟骨細胞及基質(zhì)代謝異常的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系[13]。隨著研究的深入，更多研究發(fā)現(xiàn)了與成骨分化正向和負向調(diào)控相關的miRNA，研究認為miRNA通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白、Wnt信號通路、β-catenin等影響成骨細胞增殖分化過程及骨基質(zhì)的生成、礦化，從而影響骨量[14-15]。目前臨床上已發(fā)現(xiàn)的與骨代謝異常相關的miRNA如miR-26a、miR-27、miR-29a、miR-218等，但對miRNA-92a的相關研究缺乏，參考的依據(jù)較少。本研究結(jié)果顯示，骨量減少T2DM組患者miRNA-92a水平高于骨量正常T2DM組，且與患者骨量減少程度呈正相關，表明miRNA-92a表達異常與T2DM患者骨量減少存在相關性。臨床對于已知且有特異性的與骨代謝相關的miRNA還需進一步深入研究，為臨床診治骨代謝性疾病開辟更好的途徑。

綜上所述，UACR、ALP及miRNA-92a水平與T2DM患者骨量減少存在相關性，T2DM患者UACR、ALP及miRNA-92a水平升高，其骨量減少風險增加，臨床根據(jù)醫(yī)院及患者實際情況，可將上述指標作為T2DM患者骨量減少的輔助參考指標。