CRISPR/Cas9全基因組篩選技術在疾病治療中的應用及在眼科應用中的展望

周佳木，張貝貝，王艷歌，胡旭萌，葛可可，李盼，宋宗明

(鄭州大學人民醫(yī)院/河南省人民醫(yī)院/河南省立眼科醫(yī)院/河南省眼科研究所 眼科，河南 鄭州 450003)

隨著高通量測序技術及分子生物學的發(fā)展，基因編輯技術在疾病治療中的應用不斷增加，人們希望通過研究基因的功能、敲除致病基因或插入保護基因，達到治愈疾病的目的。因此，全面探索基因的功能成為時下熱議的話題。簇狀規(guī)則間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)/CRISPR相關蛋白9(CRISPR-associated protein 9，Cas9)全基因組篩選技術可直接作用于所有編碼或非編碼序列，快速篩選具有特定生物學功能的基因或DNA片段，主要用于研究各類疾病機制、藥物開發(fā)、非編碼序列功能及剖析基因功能關系[1]。

與其他器官或系統(tǒng)相比，眼球具有體積小、范圍局限等生理結構優(yōu)勢，在使用腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)或慢病毒等載體時不會引起全身反應，中央角膜因沒有血管而免疫赦免，這有利于維持基因編輯載體的活性，眼球在各種基因編輯的探索中具有得天獨厚的優(yōu)勢。本文綜述了全基因組篩選技術在疾病治療研究中的應用進展及CRISPR/Cas9基因編輯技術在各類眼病中的廣泛應用，對全基因組篩選技術未來在眼科的應用提出展望，同時剖析了這種方法存在的問題和未來發(fā)展方向，以期為眼科疾病基因編輯治療的進一步應用提供參考。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)及全基因組篩選的原理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是從細菌免疫系統(tǒng)中發(fā)現的一種高效靈活的基因組編輯工具，由一個單鏈向導RNA(single guide RNA，sgRNA)和一個具有核酸內切酶功能的Cas9蛋白組成。在sgRNA特異性識別下，Cas9蛋白到達基因組特定位點，對雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)進行切割[2]，產生雙堿基鍵斷裂(double strand breaks，DSB)。此后，dsDNA通過細胞自主性的非同源末端連接(nonhomologous end joining，NHEJ)或同源重組(homology directed repair，HDR)引入突變[3-4]。2013年，CRISPR/Cas9系統(tǒng)首次在真核生物DNA編輯及修飾中發(fā)揮作用[5]。另外，通過改造可使核酸內切酶失活形成失活cas9(nuclease-dead mutants of Cas9, dCas9)，dCas9不能對DNA進行切割，但保留了特異性結合能力，可將不同的功能結構域融合到dCas9蛋白上，使它們發(fā)揮更多功能，如單核苷酸編輯、調控轉錄和表觀遺傳學[6]。例如dCas9通過在轉錄起始部位融合或招募轉錄因子，形成CRISPR激活(CRISPR activation，CRISPRa)和 CRISPR抑制(CRISPR interference，CRISPRi)，可特定地激活或抑制轉錄。

通過設計和合成不同sgRNA靶向細胞的全基因組序列，在細胞群內高通量地靶向敲除目的基因，并置于特定環(huán)境中進行陰性或陽性篩選，利用二代測序識別影響細胞活性的功能基因。CRISPR/Cas9全基因組篩選的具體步驟包括設計構建sgRNA文庫、慢病毒轉染、環(huán)境篩選、測序及數據分析。2014年建立了包含18 080個基因及64 751個獨特的引導序列的全基因組敲除文庫(genome-scale CRISPR/Cas9 knockout，GeCKO)與GeCKOv2[7-8]，成為人們進行全基因組篩選的有利工具。

2 CRISPR/Cas9全基因組篩選在疾病研究中的應用進展

2.1 惡性腫瘤相關研究CRISPR/Cas9全基因組篩選技術在惡性腫瘤中的研究主要應用于以下方面。(1)篩查癌癥相關因子，尋找潛在治療靶點：腫瘤的發(fā)生往往與促癌基因的活化或抑癌基因的失活有關，相關的突變基因或調節(jié)因子是藥物治療的潛在靶點。如在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)研究中，通過對AML細胞系進行CRISPR/Cas9全基因組篩選，發(fā)現PAICS基因能夠抑制AML細胞增殖，因此PAICS及其相關基因為AML治療的潛在靶點[9]。(2)尋找癌癥治療中的合成致死靶點：基因突變的癌細胞在一些其他基因突變或抑制時發(fā)生死亡，通過篩選這些癌癥基因突變的驅動因素，有利于進一步推動癌癥基因靶點的發(fā)現，同時為治療提供新途徑[10]。(3)尋找免疫治療的靶點：免疫細胞特異性基因缺失有助于更好地了解腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生中的作用，促進腫瘤的免疫治療。2020年，Li等[11]通過體內表觀遺傳學CRISPR篩查，確定了Asf1a是肺腺癌對抗PD-1治療敏感性的關鍵調節(jié)因子，Asf1a被鑒定為Kras突變型肺腺癌的免疫治療新靶點。

2.2 疾病耐藥性研究隨著藥物的研發(fā)與廣泛應用，耐藥性的發(fā)生是許多疾病治療過程中的“絆腳石”，CRISPR/Cas9全基因組篩選技術也被應用于相關研究中。(1)篩選疾病耐藥相關的突變基因或調節(jié)因子，通過對比可發(fā)現耐藥時細胞分子水平的改變。如在一定濃度魯索利替尼的環(huán)境中對急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)進行全基因組CRISPR/Cas9篩查，發(fā)現CRKL的缺失增強了野生型細胞對魯索利替尼的敏感性[12]。(2)尋找其他敏感靶點：一些治療靶點的聯合用藥能夠顯著提高藥物敏感性，減少耐藥性的發(fā)生。Lan等[13]利用CRISPR/Cas9全基因組篩查確定胰腺癌放療的敏感靶點，并通過開發(fā)放療增敏劑，為克服胰腺癌對放射治療的耐受性提供新的策略。(3)通過基因組轉錄水平調控：CRISPRa文庫及CRISPRi文庫在檢測耐藥基因方面同樣發(fā)揮重要作用。Cai等[14]利用CRISPRa文庫通過上調靶基因并誘導耐藥，發(fā)現LRP8基因可以驅動HCC細胞獲得索拉非尼耐藥性。另外，Liu等[15]利用CRISPRi文庫篩選發(fā)現lncGRS-1為加強膠質瘤放射治療的特異性治療靶點。

2.3 病毒感染相關研究病毒感染是指病毒通過多種途徑侵入機體，并在易感的宿主細胞中增殖的過程，病毒可在體內持續(xù)多年，對特定的組織、器官或系統(tǒng)造成損害。CRISPR全基因組篩選技術主要應用于以下方面[16]。(1)研究病毒-宿主的相互作用：通過CRISPR/Cas9全基因組篩選可發(fā)現病毒感染過程中進入擴散[17]、復制[18]及病毒蛋白的穩(wěn)定性[19]相關的宿主基因或宿主因子，能夠靶向病毒感染過程，截斷病毒與宿主的連接，為病毒感染的治療奠定基礎。研究發(fā)現TRIM26的缺失會特異性損害丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)基因組復制，從而確定了TRIM26是HCV復制的宿主因子，有助于HCV動物模型的建立[20]。(2)確定病毒感染的潛在治療靶點：病毒感染具有潛伏期，可躲避細胞免疫，因此找到維持潛伏期的因素至關重要。Rathore等[21]通過在人類免疫缺陷病毒潛伏期細胞系模型中利用CRISPR/Cas9全基因組功能敲除進行篩查，發(fā)現人類免疫缺陷病毒潛伏期的潛在調節(jié)因子IWS1、POLE3、POLR1B、PSMD1和TGM2。(3)免疫學研究：一些免疫因子(如干擾素)能夠抑制病毒的感染過程。如通過全基因組CRISPR篩查，研究者發(fā)現IFI6通過防止病毒誘導的內質網膜內陷的形成來預防性保護未感染的細胞，從而達到抗病毒的目的[22]。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術在眼科疾病研究中的應用進展及局限性

3.1 Leber先天性黑矇(Leber’s congenital amaurosis，LCA)LCA是一種嚴重的常染色體隱性遺傳性的視網膜疾病，無特殊治療手段。目前已發(fā)現25個基因突變與80% LCA病例相關[23]，其中對Leber先天性黑矇10型(Leber congenital amaurosis 10，LCA10)中CEP290基因突變的研究最為深入。有研究利用CRISPR/Cas9技術開發(fā)了一種候選基因組編輯療法EDIT-101[24]，通過對IVS26序列突變兩側進行切割，去除了突變產生的異常剪接供體，使CEP290基因恢復正常表達，目前EDIT-101療法已進入臨床試驗階段[25]。利用CRISPR/Cas9技術進行基因片段的特異性切割，改變CEP290基因的功能表達，有望成為治療LAC10的新途徑。

3.2 視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)RP以慢性進行性視野缺損及色盲為主要特征，其治療大多采用對癥治療及手術治療，但效果不佳。目前已明確84個基因和7個候選基因與非綜合征性RP相關，這些基因突變引起光感受器的退化，從而影響視網膜功能。其中遺傳性RP分為常染色體顯性遺傳性RP(autosomal dominant RP，ADRP)、常染色體隱性遺傳性RP(autosomal recessive RP，ARRP)與X連鎖RP(X-linked RP，XLRP)。研究表明25%的ADRP由視紫紅質(rhodopsin，RHO)基因的突變導致，而70%～90%的XLRP是視網膜色素變性三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)酶調節(jié)基因(GTPase regulator，RPGR)突變導致[26]。利用CRISPR/Cas9技術靶向切割P23H突變模型小鼠體內的RHO基因，減緩了光感受器的退化，改善了其視網膜功能[27]。2022年，Gumerson等[28]在自然突變的rd9小鼠體內靶向切除移碼突變的OFR15基因后，恢復了部分光感受器中的RPGR基因功能，并且觀察到RPGR突變相關的早期標志性疾病表型(如視錐蛋白的錯誤定位)已不復存在。這些研究展示了RP基因治療的臨床前研究進程及CRISPR/Cas9技術用于臨床研究的可行性。

3.3 原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)POAG是一種由于房水排出途徑受阻而導致眼壓增高、視野損害的不可逆性疾病，其發(fā)病隱蔽，早期可沒有任何癥狀。大約4%的歐美POAG患者被報道具有肌纖蛋白(myocilin，MYOC)基因突變。MYOC基因突變使蛋白質錯誤折疊，造成小梁網(trabecular meshwork，TM)的內質網壓力增加，從而增高眼壓。實驗表明，在具有MYOC突變的人類TM細胞和小鼠模型中進行特異性切割，能夠抑制突變MYOC的表達，從而降低眼壓，阻止青光眼的發(fā)展[29]。另有研究表明，POAG患者的TM和房水中轉化生長因子-β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)的表達比非POAG患者高約1倍[30]，特異性抑制TM細胞中TGF-β2的表達后，小鼠眼組織中TGF-β2水平降低，成功降低了小鼠的眼壓[31]。POAG家族是及時發(fā)現、治療該疾病的關鍵，而眼壓升高是其發(fā)生視野損害的關鍵因素，通過實驗證明CRISPR/Cas9特異性基因切割可快速降低小鼠眼壓，因此基因編輯有望成為POAG治療的新途徑。

3.4 先天性白內障(congenital cataract，CC)CC是一種嚴重的先天性致盲性疾病，若未及時治療，將嚴重影響患兒視力發(fā)育，盡管手術治療是有效的治療方式，但術后并發(fā)癥及術后維護十分復雜。根據報道，目前已發(fā)現超過266個基因突變與CC的發(fā)生有關[32]。研究表明，在Crygc基因顯性突變白內障模型小鼠的受精卵中，通過敲除相關基因，校正了基因突變，其后代小鼠沒有出現白內障[33]，說明通過CRISPR/Cas9技術敲除變異基因后性狀可穩(wěn)定遺傳給后代。另外，實驗證明水通道蛋白5(aquaporin5，AQP5)同樣參與晶狀體透明度的維持。Tang等[34]通過使用CRISPR/Cas9技術構建AQP5相關基因敲除小鼠模型，發(fā)現小鼠晶狀體在大約6個月時發(fā)生輕度渾濁。

3.5 單純皰疹性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)HSK是由角膜原發(fā)性或復發(fā)性單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus 1，HSV-1)感染引起的嚴重感染性角膜病，且具有潛伏性，易在機體抵抗力下降時反復發(fā)作。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以特異性在病毒基因組導入突變，從而降低病毒的活性，減輕病毒感染。ICP0和ICP4是HSV-1復制和再激活所需的2個重要基因。2020年，Chen等[35]以ICP0和ICP4作為靶點，利用CRISPR/Cas9技術高效、安全地抑制Vero細胞和小鼠三叉神經節(jié)神經元細胞培養(yǎng)中的HSV-1增殖，證明了這種基于CRISPR/Cas9的基因編輯是抗復發(fā)性HSV-1感染的有效方法。

3.6 眼科疾病基因編輯研究的局限性在目前的眼科疾病基因治療的進展中，研究者們能夠通過已有的各類基因測序工具，獲得與某一疾病相關的部分特定基因序列，對已知的基因進行精準的基因編輯：在細胞或動物實驗中構建疾病模型，通過靶向切割以驗證基因功能、改變表達性狀等，部分研究已進入臨床試驗階段。但其發(fā)展仍存在部分問題：(1)在繁冗復雜的基因網絡關系中，仍有大量編碼或非編碼序列的功能有待探索，基因之間的相互作用并不明確，這成為許多眼科疾病進入臨床研究的重大阻礙；(2)包括結膜炎、角膜炎、眼內炎、瞼緣炎、眼眶蜂窩織炎和淚囊炎等在內的細菌性炎癥的治療主要是經驗性使用廣譜抗生素。然而，廣譜抗生素的全身應用導致革蘭陽性菌和革蘭陰性菌對一些用于治療眼科感染藥物的耐藥性增加[36]，嚴重阻礙了疾病的治療。因此，掌握藥物敏感性規(guī)律或改善耐藥性，可有效預防和控制眼部感染。

4 CRISPR/Cas9全基因組篩選技術在眼科治療中的應用展望

4.1 疾病的發(fā)病機制研究CRISPR/Cas9全基因組篩選技術對探索先天性及環(huán)境因素導致的眼科疾病的致病機理具有重要意義。盡管目前已有部分突變基因為人們所知，但仍存在大量異?；蚣胺蔷幋a序列的功能有待闡述。如視網膜母細胞瘤的發(fā)生與Rb基因突變有關[37]，但部分基因突變患者會發(fā)生良性的視網膜瘤，或者發(fā)生其他的惡性腫瘤，如成骨肉瘤、小細胞肺癌等，并且不是所有患者均存在Rb基因突變。全基因組篩選技術將全面探索疾病的發(fā)病機制，為我們提供更多的潛在研究靶點。

4.2 基因治療靶點的發(fā)現利用CRISPR/Cas9全基因組篩選技術在已知的突變基因基礎上探索疾病發(fā)生的協(xié)同作用基因或調節(jié)因子或尋找新的免疫治療靶點，將成為一些眼部疾病治療的新方向。另外，眼部惡性腫瘤的合成致死靶點的發(fā)現將有助于惡性腫瘤的抑制和死亡。

4.3 耐藥性研究目前眼科最常見的細菌感染為表皮葡萄球菌與銅綠假單胞菌，其細菌分離物對四環(huán)素、左氧氟沙星、頭孢吡肟、氨芐西林等表現出較高耐藥性[36]。另外，不少患者已出現普遍耐藥。利用CRISPR/Cas9全基因組篩選技術對比藥物治療過程中的基因改變，揭示這些耐藥發(fā)生的分子機制，可指明藥物的進一步研發(fā)方向和聯合用藥的治療靶點。

4.4 與CRISPR/Cas9基因編輯技術的結合應用CRISPR/Cas9基因編輯技術能夠特異性識別并編輯目的基因，高效快速地驗證基因功能，已在眼科疾病研究中得到廣泛應用。全基因組篩選技術能夠快速篩選疾病表型相關基因，即為基因編輯提供可能的目的基因片段，這將大幅度擴大基因功能探索的范圍，提升效率。盡管它們的應用均受到脫靶效應的影響，但目前已出現一些降低脫靶效應的有效措施。

5 總結

綜上所述，CRISPR/Cas9全基因組篩選技術是一種可廣泛應用于各個領域的基因表型篩選方法，能夠全面闡述疾病表型與基因改變的對應關系，具有特異性強、高效便捷等不可替代的優(yōu)勢。與RNAi篩選不同，這種篩選技術將功能缺失突變引入基因組DNA，并且可以靶向調控整個基因組的元件，包括啟動子、增強子、內含子等。另外，RNAi通過mRNA結合和轉錄降解在轉錄后水平調控基因的表達，這種類型的表達抑制是暫時、可恢復的[38]，而GeCKO文庫執(zhí)行基因敲除，在基因組中產生永久性的變化。目前，該技術在各系統(tǒng)腫瘤相關基因、化療藥物耐藥性、病毒感染治療及先天性疾病研究等方面已取得部分進展，在細胞及動物實驗中得到驗證[39]。但存在部分問題有待解決：(1)目前常用的GeCKO文庫主要包括人源與鼠源，并且價格昂貴，抑制了其廣泛應用及發(fā)展。若由實驗室搭建文庫，則前期需要花費大量的時間成本，將嚴重影響實驗進度；(2)進入細胞時依賴不同的載體，如慢病毒、AAV等，對于不同的細胞，不同載體的感染效率具有一定差異；(3)該技術是在全基因組范圍內進行靶向識別并切割，故存在脫靶效應。

盡管如此，該技術在眼科各類疾病治療中具有很大的應用前景，通過全方面探索眼科疾病相關基因并構建基因網絡，結合CRISPR/Cas9技術驗證其生物學過程，將“基因功能探索”與“目的基因編輯”相結合，有助于進一步的新藥研發(fā)、耐藥性分析等，將進一步促進基因治療在眼科疾病中的有效應用。