基因表達(dá)與直腸癌免疫治療效果的關(guān)系

史昊，李小麗，楊玉丹，馬青青，侯一丹，高明

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，河南 鄭州 450000)

消化道腫瘤是在世界范圍內(nèi)流行的疾病，在前十位發(fā)病率的腫瘤中占據(jù)4席[1]。其中結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)排第3位，是導(dǎo)致全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[2]。直腸癌約占CRC的30%，局部晚期直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療是新輔助放化療，再行全直腸系膜切除術(shù)[3-4]?；?-Fu聯(lián)合鉑類的化療方案是早中期直腸癌新輔助或輔助治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，主要包括輸注氟尿嘧啶及亞葉酸，或每日口服卡培他濱、替吉奧[5-6]。基因測(cè)序是腫瘤治療過程中的重要檢查手段，在靶向治療中最核心的一環(huán)就是通過基因檢測(cè)獲得靶向治療的間接指導(dǎo)和預(yù)測(cè)信息[7]，以尋求最佳治療方案，如KRAS基因，試驗(yàn)證明FOLFIRI方案聯(lián)合針對(duì)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的單克隆抗體西妥昔單抗已被證明可降低KRAS野生型患者的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)[8]。

腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutational burden，TMB)是通過測(cè)序非同義體細(xì)胞基因突變的數(shù)量獲得的，更高的TMB意味著腫瘤可能會(huì)產(chǎn)生更多的新抗原，誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞參與反應(yīng)，并進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤免疫。除了一些特定的基因改變外，我們認(rèn)為絕大多數(shù)腫瘤DNA的改變與靶向治療的反應(yīng)有關(guān)。TMB已用作體細(xì)胞突變積累的替代測(cè)量。許多臨床研究強(qiáng)化了TMB作為預(yù)測(cè)靶向治療結(jié)果的獨(dú)立生物標(biāo)志物的概念。與高TMB患者相比，TMB較低的患者的反應(yīng)率和生存率較差[9-14]。

非小細(xì)胞肺癌免疫治療中的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物包括程序性死亡蛋白配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)狀態(tài)、TMB、錯(cuò)配修復(fù)缺陷(mismatch repair deficiency，dMMR)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)等[15]。對(duì)于CRC患者，除了程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)抑制劑單藥一線治療MSI-H/dMMR晚期CRC的地位不可動(dòng)搖，已作為最高級(jí)別的Ⅰ類推薦寫進(jìn)中國抗癌協(xié)會(huì)臨床腫瘤學(xué)協(xié)作專業(yè)委員會(huì)(Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO)指南，余標(biāo)志物是否在CRC免疫治療中扮演類似角色尚不確定[16]。本文目的在于探究部分基因的表達(dá)是否可作為新的生物標(biāo)志物，對(duì)直腸癌患者免疫治療有指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2015年1月至2021年10月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的102例直腸惡性腫瘤患者，腫瘤病理類型均為腺癌，患者均接受過基于二代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)法的基因檢測(cè)及至少2周期的抗PD-1免疫治療，患者及家屬在接受治療前均簽署知情同意書。直腸癌患者共有102例，包含男56例，女46例；年齡<55歲50例，≥55歲52例；有吸煙飲酒史21例；Ⅲ期腫瘤15例，Ⅳ期腫瘤87例；以下各組年齡、性別、吸煙飲酒史、腫瘤分期差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn) (1)在治療前接受過基因檢測(cè)且能準(zhǔn)確查詢到基因檢測(cè)報(bào)告；(2)在二線治療方案失敗后通過影像學(xué)確認(rèn)病灶進(jìn)展后開始接受正規(guī)規(guī)律免疫治療；(3)至少接受過2周期正規(guī)抗PD-1免疫治療后定期復(fù)查；(4)根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST1.1)[17]評(píng)估至少含1個(gè)可測(cè)量病灶；(5)美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)體力狀況評(píng)分為0～1分；(6)年齡≥18歲，性別不限；(7)規(guī)律隨訪，依從性良好，臨床資料完整；(8)對(duì)治療有較好的耐受性，無嚴(yán)重不良反應(yīng)。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn) (1)接受免疫治療小于2周期；(2)雖接受免疫治療至少2周期，但未行影像學(xué)確認(rèn)病灶進(jìn)展即改變治療方案；(3)免疫治療使病灶緩解后又行局部手術(shù)或介入治療；(4)治療過程中出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)而停止治療；(5)有神經(jīng)疾病或精神疾病史；(6)已知具有嚴(yán)重或未能控制的基礎(chǔ)疾??；(7)存在治療禁忌證。

1.3 治療方法在患者二線方案治療失敗后(影像學(xué)確認(rèn)病灶進(jìn)展)，給予患者抗PD-1受體抑制劑應(yīng)用，包括卡瑞利珠單抗(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，國藥準(zhǔn)字S20190027)、特瑞普利單抗(上海駿實(shí)生物科技有限公司，國藥準(zhǔn)字S20180015)、信迪利單抗[信達(dá)生物(蘇州)有限公司，國藥準(zhǔn)字S20180016]，3種抗PD-1受體抑制劑療效差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？ㄈ鹄閱慰姑看蚊恐?00 mg配入100 mL 9 g·L-1的氯化鈉溶液中靜脈滴注，每個(gè)治療周期1次；特瑞普利單抗每次每支240 mg配入9 g·L-1的氯化鈉溶液100 mL中靜脈滴注，每個(gè)治療周期1次；信迪利單抗每次每支200 mg配入9 g·L-1的氯化鈉溶液100 mL中靜脈滴注，每個(gè)治療周期1次，14～21 d為1個(gè)周期，直至患者不能耐受或因疾病進(jìn)展而終止治療或死亡，觀察評(píng)價(jià)臨床療效。

1.4 療效觀察收集患者每個(gè)周期治療前的基線資料，采用胸及全腹部增強(qiáng)CT、腦部MRI及全身骨掃描等評(píng)估全身病灶，采用實(shí)體腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST1.1)[17]評(píng)價(jià)療效，包括完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)和疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)?？陀^緩解率(objective response rate，ORR)為CR率與PR率之和；臨床獲益率(clinical benefit rate，CBR)為CR率、PR率、SD率之和。隨訪記錄無進(jìn)展生存期(progression free survival，PFS)和不良反應(yīng)。免疫治療過程中的常見不良反應(yīng)包括皮疹、胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、肝功能損傷等(1～2級(jí)不良反應(yīng)為輕度；≥3級(jí)不良反應(yīng)為重度)，患者治療過程中各組無治療相關(guān)死亡出現(xiàn)。至少接受免疫治療2個(gè)周期后采用影像學(xué)檢查評(píng)估臨床療效。每周期治療前1 d、第4天復(fù)查血常規(guī)及肝、腎功能評(píng)估不良反應(yīng)。通過在院觀察及電話隨訪獲得患者的相關(guān)資料。隨訪記錄至患者不能耐受或因疾病進(jìn)展而終止治療或死亡，隨訪截止至2021年12月31日。研究終點(diǎn)：主要終點(diǎn)為中位PFS，次要終點(diǎn)為ORR及CBR。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。組間比較采用校正χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法等，通過Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank檢驗(yàn)比較生存率。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 突變基因影響采用基于NGS法的基因檢測(cè)對(duì)符合條件的102例患者的腫瘤組織進(jìn)行突變基因檢測(cè)(其中12例患者僅行K-RAS、N-RAS、BRAF、PIK3CA4項(xiàng)基因檢測(cè)；3例患者僅行K-RAS、N-RAS、BRAF3項(xiàng)基因檢測(cè))，記錄突變基因的名字及突變數(shù)量(部分基因的突變?nèi)藬?shù)過少，未列出)。見表1。其中K-RAS、SMAD4、TP53、APC、MYC陽性或陰性例數(shù)均不少于20例，可用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析；余基因陽性或陰性突變例數(shù)相差較大，不予分析。

表1 突變基因及對(duì)應(yīng)例數(shù)

2.1.1K-RAS基因 根據(jù)K-RAS基因突變情況分為兩組，ORR及CBR在K-RAS(﹢)和K-RAS(-)的患者中比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。若以PFS考量?jī)山M的差異性，K-RAS(﹢)患者中位PFS為3.5個(gè)月(95% CI：2.27～4.73)，K-RAS(-)患者中位PFS為4.0個(gè)月(95% CI：2.91～5.09)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.469)。見圖1。

表2 K-RAS基因突變對(duì)ORR及CBR的影響比較[n(%)]

圖1 K-RAS基因突變中位PFS比較

2.1.2SMAD4基因 根據(jù)SMAD4基因突變情況分為兩組，ORR及CBR在SMAD4(+)和SMAD4(-)的患者中比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。若以PFS考量?jī)山M的差異性，SMAD4(+)患者中位PFS為3.5個(gè)月(95% CI：2.40～4.60)，SMAD4(-)患者中位PFS為3.0個(gè)月(95% CI：2.20～3.81)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.458)。見圖2。

表3 SMAD4基因突變對(duì)ORR及CBR的影響比較[n(%)]

圖2 SMAD4基因突變中位PFS比較

2.1.3TP53基因 根據(jù)TP53基因突變情況分為兩組，TP53(+)和TP53(-)患者ORR及CBR比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。若以PFS考量?jī)山M的差異性，TP53(+)患者中位PFS為3.5個(gè)月(95% CI：2.83～4.17)，TP53(-)患者中位PFS為2.0個(gè)月(95% CI：0.356～3.64)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.589)。見圖3。

表4 TP53基因突變對(duì)CBR影響對(duì)比[n(%)]

圖3 TP53基因突變中位PFS比較

2.1.4APC基因 根據(jù)APC基因突變情況分為兩組，APC(+)和APC(-)患者的ORR及CBR比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。若以PFS考量?jī)山M的差異性，APC(+)患者中位PFS為3.0個(gè)月(95% CI：1.96～4.04)，APC(-)患者中位PFS為3.5個(gè)月(95% CI：2.29～4.70)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.860)。見圖4。

表5 APC基因突變對(duì)CBR影響對(duì)比[n(%)]

圖4 APC基因突變中位PFS比較

2.1.5MYC基因 根據(jù)MYC基因突變情況分為兩組，MYC(+)和MYC(-)患者ORR及CBR比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表6。若以PFS考量?jī)山M的差異性，MYC(+)患者中位PFS為2.5個(gè)月(95% CI：1.40～3.60)，MYC(-)患者中位PFS為3.5個(gè)月(95% CI：2.83～4.17)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.120)。見圖5。

表6 MYC基因突變對(duì)CBR影響對(duì)比[n(%)]

圖5 MYC基因突變中位PFS比較

2.2 TMB影響采用基于NGS法基因檢測(cè)的符合條件的102例患者，對(duì)87例患者的腫瘤組織進(jìn)行了TMB的檢測(cè)，記錄每個(gè)腫瘤的TMB值，根據(jù)TMB突變量分為兩組(突變量<8為一組，突變量≥8為另一組)。低TMB組和高TMB組患者ORR比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組CBR比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表7。PFS分布見圖6。若以PFS考量?jī)山M的差異性，高TMB患者中位PFS為5.0個(gè)月(95% CI：3.12～6.88)，低TMB患者中位PFS為3.0個(gè)月(95% CI：1.80～4.20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖7。

表7 TMB突變量對(duì)CBR影響對(duì)比[n(%)]

2.3 不良反應(yīng)各組不良反應(yīng)發(fā)生率比較，其中APC(+)與APC(-)、SMAD4(+)與SMAD4(-)患者間肝功能損傷比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，APC(-)患者肝功能損傷發(fā)生率較APC(+)患者高(χ2=9.000，P=0.003)，SMAD4(+)患者肝功能損傷發(fā)生率較SMAD4(-)患者高(χ2=5.896，P=0.015)；MYC(+)與MYC(-)患者間的輕度骨髓抑制出現(xiàn)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MYC(+)患者輕度骨髓抑制發(fā)生率較MYC(-)患者高(χ2=11.358，P<0.001)；余各組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表8。

圖6 PFS分布散點(diǎn)圖

圖7 高TMB組和低TMB組的中位PFS比較

表8 各組不良反應(yīng)發(fā)生率比較

3 討論

近年來，免疫療法的引入作為癌癥治療的突破口。免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitor，ICI)療法，包括抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4療法，在增強(qiáng)有效T細(xì)胞的活性和抑制腫瘤微環(huán)境生長方面發(fā)揮了作用[18-19]。多數(shù)人認(rèn)為免疫療法是一種前途光明的治療方法，已進(jìn)行了數(shù)年的研究。盡管一些研究表明直腸癌患者對(duì)免疫療法很敏感，但在臨床實(shí)踐中只取得了很小的獲益。目前通過抑制免疫檢查點(diǎn)途徑取得的成功，尤其是PD-1途徑，是免疫治療的一個(gè)突破。腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1與T細(xì)胞上的PD-1結(jié)合，抑制T細(xì)胞的抗腫瘤功能，導(dǎo)致效應(yīng)期免疫逃逸及免疫循環(huán)。考慮到藥物有效率，需要預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物來確定更有可能對(duì)ICI產(chǎn)生反應(yīng)的患者，并確定對(duì)ICI有抵抗力并需要聯(lián)合治療或改變治療的患者[20]。

根據(jù)分析結(jié)果，直腸癌高TMB患者較低TMB患者接受免疫治療而言，呈現(xiàn)出更長的PFS和CBR，Goodman等[21]的研究結(jié)果表明通過基于雜交捕獲的NGS檢測(cè)1.2 Mb基因組測(cè)量的TMB可以預(yù)測(cè)除黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌之外的許多類型的抗PD-1/PD-L1免疫治療的結(jié)果，他們驗(yàn)證了與較低的患者相比，TMB高的患者有著更高的緩解率、更長的PFS和總生存期(overall survival，OS)，并且TMB與結(jié)果之間的相關(guān)性呈線性關(guān)系。但這是基于所有腫瘤類型而言的，當(dāng)排除黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌患者時(shí)，較高的TMB與較好的緩解率和PFS之間的關(guān)聯(lián)仍然顯著，OS卻失去了意義。本文的研究對(duì)象為直腸癌患者，也同樣證實(shí)了高TMB預(yù)示了更好的PFS和CBR，這點(diǎn)與Goodman等[21]結(jié)論一致，但ORR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與臨床數(shù)據(jù)過少有關(guān)。TMB可作為直腸癌PD-1/PD-L1治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一，但它并不是完美的，高TMB組仍有個(gè)別病例PFS短于6個(gè)月；低TMB組也存在PFS高于高TMB組(圖6)。

而突變基因結(jié)果顯示K-RAS、SMAD4、TP53、APC、MYC基因突變與否和直腸癌免疫治療預(yù)后無關(guān)，雖然ORR、CBR、PFS均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但部分基因ORR和CBR的結(jié)果與PFS的結(jié)果似乎產(chǎn)生了矛盾，例如K-RAS(+)組ORR、CBR雖稍高于K-RAS(-)組，但中位PFS卻稍低于后者，可能與兩組樣本量差距較大以及評(píng)價(jià)療效時(shí)主觀性帶來的誤差有關(guān)，雖然存在矛盾，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以這種矛盾也失去了意義。突變譜系是非常龐大的，而每名患者的突變基因具有隨機(jī)性，個(gè)別基因的突變又是極其罕見的，所以迫切需要更多的數(shù)據(jù)來論證。雖然Stockton等[22]的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤治療前組織中可檢測(cè)出豐富的PIK3CA和FBXW7基因，并且在治療后仍豐富，這意味著它們可能是反應(yīng)性差的生物標(biāo)志物。但此項(xiàng)研究涉及的治療手段太多，不限于免疫治療，所以這些基因?qū)τ诿庖咧委煹姆磻?yīng)性仍有待考據(jù)。

可能成為直腸癌免疫治療療效的靶點(diǎn)還有很多，其中包含了PD-L1表達(dá)量、微衛(wèi)星穩(wěn)定性(microsatellite stability，MSS)等，但本文收集數(shù)據(jù)過程中，并未發(fā)現(xiàn)過多患者在治療前檢測(cè)PD-L1表達(dá)量，且超過95%的患者微衛(wèi)星穩(wěn)定。據(jù)Devaraj等[23]調(diào)查，直腸癌患者中的MSI很少見，迄今為止，人們對(duì)直腸癌的MSI子集的表達(dá)知之甚少，本文數(shù)據(jù)收集也與此相符，所以未對(duì)MSS的差異進(jìn)行探討。關(guān)于PD-L1，學(xué)界存在爭(zhēng)議，既有Ozawa等[24]論證了PD-L1在腫瘤組織中的高表達(dá)；又有Jomrich等[25]未在轉(zhuǎn)移腫瘤組織中檢出高表達(dá)的PD-L1。由于預(yù)測(cè)CRC免疫治療療效的標(biāo)志物太少，現(xiàn)如今直腸癌的免疫治療仍不作為主流選擇。

本文研究仍有一些局限性。首先，它是回顧性的；其次，用于回顧的患者數(shù)量過少，代表性不強(qiáng)；第三，評(píng)估療效上存在一定的主觀性；第四，癌癥不是靜止的，并且可以隨著它們的進(jìn)化而獲得突變。NGS通常在舊的活檢標(biāo)本上進(jìn)行，因此測(cè)試的樣本可能無法準(zhǔn)確反映腫瘤當(dāng)前的狀態(tài)。

綜上所述，本研究表明直腸癌高TMB患者相比低TMB患者接受免疫治療而言，呈現(xiàn)出更長的PFS和CBR，TMB作為直腸癌預(yù)后指標(biāo)有一定意義；K-RAS、SMAD4、TP53、APC、MYC基因突變與否和直腸癌免疫治療預(yù)后無關(guān)，為進(jìn)一步論證，還需要更大規(guī)模的研究。