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    MMPs激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2以及Ⅰ型膠原表達(dá)的作用研究△

    2013-03-03 00:29:32鄒蕾蕾劉睿劉紅黃莉雯周行濤周浩
    中國(guó)眼耳鼻喉科雜志 2013年2期
    關(guān)鍵詞:鞏膜激動(dòng)劑膠原蛋白

    鄒蕾蕾 劉睿 劉紅 黃莉雯 周行 濤周浩

    ·基礎(chǔ)研究·

    MMPs激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2以及Ⅰ型膠原表達(dá)的作用研究△

    鄒蕾蕾 劉睿 劉紅 黃莉雯 周行 濤周浩

    目的研究基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族MMP-1、MMP-2激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)人鞏膜Ⅰ型膠原表達(dá)的作用,探討MMP-1和MMP-2在人鞏膜膠原代謝中的作用。方法應(yīng)用人鞏膜成纖維細(xì)胞系作為研究模型,用熒光定量檢測(cè)MMPs激動(dòng)劑醋酸氨基苯汞(APMA)及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1和MMP-2活性的影響;實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)以及免疫印跡蛋白定量法檢測(cè)比較激動(dòng)劑組與抑制劑組對(duì)MMP-1/2以及Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)的變化;最后用siRNA干擾敲除MMP-1、MMP-2或MMP-1/2后,檢測(cè)鞏膜成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白水平的變化。結(jié)果MMPs激動(dòng)劑引起MMP-1/2活性顯著增加,Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)下降,MMPs抑制劑引起MMP-1/2活性顯著下降,相應(yīng)的Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)增加(均P<0.01)。激動(dòng)劑可引起MMP-1 mRNA表達(dá)增加(P<0.01),對(duì)MMP-2 mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05),而抑制劑能引起MMP-2 mRNA表達(dá)下降(P<0.01),但對(duì)MMP-1 mRNA表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05)。應(yīng)用siRNA干擾方法敲除MMP-1、MMP-2或兩者同時(shí)被敲除后,MMP-1蛋白表達(dá)均顯著降低(均P<0.01),MMP-2除在MMP-1 siRNA干擾敲除組無(wú)明顯變化外(P>0.05),其余各組均顯著下降(均P<0.01);Ⅰ型膠原的表達(dá)在各敲除組中顯著增加,當(dāng)MMP-1和MMP-2均干擾敲除時(shí),Ⅰ型膠原的表達(dá)增加最為顯著(均P<0.01)。結(jié)論在人鞏膜成纖維細(xì)胞系中,MMP-1/2激動(dòng)劑和抑制劑均能引起MMP-1/2活性改變及相應(yīng)的MMP-1/2蛋白表達(dá)變化,并最終導(dǎo)致Ⅰ型膠原表達(dá)的變化;MMP-1和MMP-2是調(diào)控人鞏膜Ⅰ型膠原重塑的關(guān)鍵因子。(中國(guó)眼耳鼻喉科雜志,2013,13:91-95)

    人鞏膜成纖維細(xì)胞;基質(zhì)金屬蛋白酶1;基質(zhì)金屬蛋白酶2;膠原,Ⅰ型

    近視是由于眼軸異常延長(zhǎng)所致。因此,明確近視眼眼軸延長(zhǎng)的機(jī)制,是控制近視發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵。大量研究[1-4]提示,鞏膜的細(xì)胞外基質(zhì)重塑以及生物力學(xué)方面的變化,可能導(dǎo)致眼軸增長(zhǎng),近視形成?;|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一系列能降解多種大分子物質(zhì)的酶,幾乎能夠降解除多糖以外的全部細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)成分。目前研究[5-6]發(fā)現(xiàn)鞏膜I型膠原改變與MMPs密切相關(guān),其中MMP-1、MMP-2均可以降解Ⅰ型和Ⅱ型膠原。已發(fā)現(xiàn)人鞏膜成纖維細(xì)胞上有MMP-1和MMP-2表達(dá),然而尚無(wú)體外實(shí)驗(yàn)證明MMP-1、MMP-2激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMPs及Ⅰ型膠原表達(dá)的影響,因此本研究用人鞏膜成纖維細(xì)胞系來(lái)研究MMP-1、MMP-2對(duì)Ⅰ型膠原的作用,應(yīng)用siRNA干擾方法敲除MMP-1或MMP-2后,檢測(cè)鞏膜成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA和蛋白水平的變化,從而明確探討MMP-1、MMP-2是否是引起人鞏膜I型膠原降解的關(guān)鍵因子,為今后進(jìn)一步闡明MMP-1和MMP-2在近視眼眼軸延長(zhǎng)中的作用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料及試劑 人鞏膜成纖維細(xì)胞系(中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)、β-actin(Santa Cruz公司,美國(guó))、無(wú)水乙醇(溶于DEPC處理的水中)、Trizol試劑(Invitrogen公司,美國(guó))、三蒸水(無(wú)RNA酶水)、羊抗兔IgG-HRP試劑盒(北京博奧森生物)、顯影液(KODA公司,美國(guó))、定影液(KODA公司,美國(guó))、ECL發(fā)光試劑盒A、B液(武漢博士得公司)、MMP-1抑制劑Z-Pro-Leu-Gly-NHOH(ENZO公司,美國(guó))、MMP-2抑制劑ARP-101(SIGMA-ALDRICH公司,美國(guó))及MMPs激動(dòng)劑(SIGMA公司,美國(guó))等。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 檢測(cè)激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)MMP-1/2活性的影響

    (1)用熒光定量法檢測(cè)MMPs激動(dòng)劑醋酸氨基苯汞(P-aminophenylmercuric acetate,APMA)及MMP-1抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1活性的影響:將人鞏膜成纖維細(xì)胞種在6孔培養(yǎng)板中,等細(xì)胞密度達(dá)到80%后,加入APMA(1 mmol/L)處理細(xì)胞2 h或Z-Pro-Leu-Gly-NHOH處理細(xì)胞18 h,裂解細(xì)胞,按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定MMP-1的活性。

    (2)采用酶譜法檢測(cè)APMA及MMP-2抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-2活性的影響:將人鞏膜成纖維細(xì)胞種在6孔培養(yǎng)板中,等細(xì)胞密度達(dá)到80%,加入APMA(1 mmol/L)處理細(xì)胞18 h或ARP-101處理細(xì)胞18 h,裂解細(xì)胞,按前述酶譜法測(cè)定MMP-2的活性。

    1.2.2 測(cè)量MMP-1/2mRNA以及I型膠原mRNA的表達(dá)

    (1)目的基因引物的合成:引物由上海基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中心合成。引物序列如下:β-actin的擴(kuò)增大小148 bp,上游引物:5′GCACCCAGCCAATATAGGAC3′,下游引物:5′AGAATTGTCCCTTGGCCTCT3′;MMP-1擴(kuò)增大小為354 bp,上游引物:5′AGGTTATCCCAAAATGA TAG3′,下游引物:5′TGCAGTTGAACCAGCTATTA3′;MMP-2擴(kuò)增大小為90 bp,上游引物:5′TACAGG ATCATTGGCTACACACC3′,下游引物:5′GGTCACA TCGCTCCAGACT3′;膠原I擴(kuò)增大小為125 bp,上游引物:5′GCACCTCTCACTCCATTACA3′,下游引物:5′AAATGAAAGTCAAGGGGAAC3′。

    (2)Trizol法提取細(xì)胞總mRNA,RT試劑盒對(duì)總mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA。

    (3)實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcriptional polymerase chain reaction,RTPCR):PCR反應(yīng)液中,cDNA 0.5μL,上游引物0.5μL,下游引物0.5μL,SYBS green supermix 12.5 μL,去離子水6μL。把配制好的PCR反應(yīng)液20μL置入200μL的滅菌離心管,迅速放入FeroTec Gradien PCR擴(kuò)增儀,按擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

    (4)將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA樣本各取1μL,在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增及檢測(cè)熒光強(qiáng)度,自動(dòng)繪制動(dòng)力學(xué)曲線,判讀其Ct值。采用比較閾值法計(jì)算待測(cè)樣本中目的基因表達(dá)相對(duì)于校正樣本的變化倍數(shù)。

    1.2.3 檢測(cè)MMP-1/2以及I型膠原蛋白的表達(dá) 免疫印跡蛋白定量(Western-blot)方法檢測(cè):收集細(xì)胞,用冷磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)洗滌3次后,將細(xì)胞重懸于細(xì)胞裂解液中,冰浴6 min,使細(xì)胞充分裂解離心,收集上清液,分裝凍存配置BCA工作液;分別吸25μL標(biāo)準(zhǔn)品,待測(cè)樣品至微孔板對(duì)應(yīng)孔中,每孔加入200μL BCA工作液,震蕩6 s以徹底混合均勻。蓋好微孔板,7℃孵育6 min,冷卻至室溫。測(cè)量各孔590 nm吸光度值,測(cè)得的每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔的吸光度值分別減去空白孔平均吸光度值。以校正過(guò)的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè)量值對(duì)其濃度(mg/L)做圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,使用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量待測(cè)樣品蛋白濃度,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳完畢后對(duì)凝膠進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢取出PVDF膜,置于含50 mg/L脫脂奶粉的TTBS封閉液中,于室溫封閉2 h與一抗結(jié)合,洗膜。二抗結(jié)合,抗體結(jié)合區(qū)帶用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè),信號(hào)強(qiáng)度用Bio 1D圖像分析軟件進(jìn)行相對(duì)定量分析。

    1.2.4 siRNA干擾 在人鞏膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染合成的MMP-1 siRNA或MMP-2 siRNA以及對(duì)照siRNA,轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞,用免疫印跡蛋白定量檢測(cè)MMP-1、MMP-2蛋白水平的變化,確證siRNA干擾的效果。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。凡對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間差異分別行配對(duì)t檢驗(yàn),組間差異行完全隨機(jī)單因素方差分析,組間兩兩比較采用Bonferroni法。方差不齊時(shí),采用Games-Howell法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2活性的影響 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2活性的影響(表1)顯示,MMP-1激動(dòng)劑組、抑制劑組及對(duì)照組之間相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=534.328,P<0.001);和對(duì)照組相比,激動(dòng)劑組MMP-1活性增高,抑制劑組MMP-1活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。MMP-2激動(dòng)劑組、抑制劑組及對(duì)照組之間相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=250.628,P<0.001);和對(duì)照組相比,MMP-2激動(dòng)劑組MMP-2活性增高,MMP-2抑制劑組MMP-1活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

    表1 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2的活性影響

    2.2 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2及Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)的影響 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2及Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)(表2)顯示:MMP-1激動(dòng)劑組、MMP-1抑制劑組及對(duì)照組之間,MMP-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCt)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=174.030,P<0.001);與對(duì)照組相比,MMP-1激動(dòng)劑組MMP-1 mRNA的表達(dá)明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.009),但MMP-1抑制劑組與對(duì)照組相比,兩組間MMP-1 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.9)。MMP-1激動(dòng)劑組、MMP-1抑制劑組及對(duì)照組之間,Ⅰ型膠原蛋白mRNA的相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCt)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=381.946,P<0.001);與對(duì)照組相比,MMP-1激動(dòng)劑組Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021),MMP-1抑制劑組Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。

    MMP-2激動(dòng)劑組、MMP-2抑制劑組以及正常對(duì)照組MMP-2mRNA的相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCt)之間,MMP-2 mRNA總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=126.924,P<0.001);與正常對(duì)照組相比,MMP-2抑制劑組MMP-2 mRNA表達(dá)顯著減少(P<0.001),但MMP-2激動(dòng)劑組與之相比,MMP-2mRNA的表達(dá)無(wú)明顯改變(P= 0.186);MMP-2激動(dòng)劑組、MMP-2抑制劑組以及正常對(duì)照組中Ⅰ型膠原蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCt)之間,各組Ⅰ型膠原蛋白mRNA總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=69.815,P<0.001);與對(duì)照組相比,MMP-2激動(dòng)劑組Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)顯著減少(P= 0.003),MMP-2抑制劑組Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)顯著增加(P=0.004)。

    表2 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2及Ⅰ型膠原蛋白m RNA表達(dá)

    2.3 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2及Ⅰ型膠原蛋白水平的影響 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2及Ⅰ型膠原蛋白水平(表3)示:MMP-1激動(dòng)劑組,MMP-1抑制劑組以及對(duì)照組MMP-1表達(dá)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1062.700,P<0.001);與正常對(duì)照組相比,MMP-1激動(dòng)劑組MMP-1表達(dá)明顯增多(P<0.001),而MMP-1抑制劑組MMP-1表達(dá)明顯減少(P<0.001);MMP-1激動(dòng)劑組,MMP-1抑制劑組以及正常對(duì)照組Ⅰ型膠原蛋白各組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1204.000,P<0.001);與對(duì)照組相比,MMP-1激動(dòng)劑組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.001),而MMP-1抑制劑組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.001)。MMP-2激動(dòng)劑組、MMP-2抑制劑組以及對(duì)照組MMP-2表達(dá)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=295.125,P<0.001);與對(duì)照組相比,MMP-2激動(dòng)劑組MMP-2表達(dá)明顯增多(P<0.001),而MMP-2抑制劑組MMP-2表達(dá)明顯減少(P<0.001);APMA處理組,MMP-2抑制劑組以及正常對(duì)照組各組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=567.000,P<0.001);與正常對(duì)照組相比,MMP-2激動(dòng)劑組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.001),而MMP-2抑制劑組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.001)。

    表3 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2及Ⅰ型膠原蛋白水平

    2.4 siRNA干擾敲除MMPs后,鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2和Ⅰ型膠原蛋白水平的變化 siRNA干擾敲除MMPs后,鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2和Ⅰ型膠原蛋白水平(表4)示:對(duì)照組、MMP-1干擾敲除組、MMP-2干擾敲除組以及MMP-1聯(lián)合MMP-2干擾敲除組中,各組MMP-1表達(dá)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 653.639,P<0.001);與對(duì)照組相比,其余各組MMP-1表達(dá)明顯減少(P<0.001),尤其以MMP-1干擾敲除組以及MMP-1聯(lián)合MMP-2干擾敲除組MMP-1表達(dá)降低最為明顯;對(duì)照組、MMP-1干擾敲除組、MMP-2干擾敲除組以及MMP-1聯(lián)合MMP-2干擾敲除組中,各組MMP-2表達(dá)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 868.458,P<0.001);與正常對(duì)照組相比,MMP-2干擾敲除組以及MMP-1聯(lián)合MMP-2干擾敲除組中MMP-2蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.001),而MMP-1干擾敲除組中MMP-2蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變(P>0.05);對(duì)照組、MMP-1干擾敲除組、MMP-2干擾敲除組以及MMP-1聯(lián)合MMP-2干擾敲除組中,各組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2298.210,P<0.001);與對(duì)照組相比,其余各組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.001),其中MMP-1聯(lián)合MMP-2干擾敲除組中Ⅰ型膠原蛋白升高最為顯著(P<0.001)。

    表4 siRNA干擾敲除MMPs后,鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2和Ⅰ型膠原蛋白水平

    3 討論

    眼軸延長(zhǎng)是近視發(fā)展的最基本病理過(guò)程。鞏膜作為近視調(diào)控機(jī)制的最終靶組織,眼軸的延長(zhǎng)總是伴隨鞏膜組織的進(jìn)行性改變。高度近視患者可以發(fā)現(xiàn)鞏膜顯著變薄,尤其在眼球后極部。這種形態(tài)學(xué)的變化,與鞏膜的生物力學(xué)特性密切相關(guān),變薄的鞏膜中膠原和葡聚多糖含量減少,鞏膜延展性增加[4,7]。鞏膜組織的重塑過(guò)程包括原有組織的降解和新組織的合成,降解與合成之間平衡的改變和近視發(fā)展密切相關(guān)[8-9]。在鳥類、哺乳動(dòng)物以及人類的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn),MMPs家族調(diào)節(jié)近視眼鞏膜組織的降解過(guò)程[10-15]。盡管其他MMPs家族成員也可能參與鞏膜組織的重塑過(guò)程,但是MMP-1或MMP-2目前被認(rèn)為是最強(qiáng)的調(diào)控因子[16]。目前有大量文獻(xiàn)研究[10,12,16-19]證實(shí),無(wú)論是形覺剝奪還是光學(xué)離焦誘導(dǎo)的近視動(dòng)物模型,鞏膜MMP-2表達(dá)增加,細(xì)胞外基質(zhì)降解增加,鞏膜重塑,近視發(fā)生;而在近視恢復(fù)期時(shí),MMP-2表達(dá)下降。因此,從細(xì)胞水平探討MMP-1/2激動(dòng)劑或抑制劑對(duì)鞏膜成纖維細(xì)胞的作用以及對(duì)Ⅰ型膠原表達(dá)的影響,將能進(jìn)一步揭示鞏膜重塑的機(jī)制。

    本研究通過(guò)體外細(xì)胞模型,檢測(cè)MMP-1及MMP-2激動(dòng)劑、抑制劑對(duì)MMP-1或MMP-2以及Ⅰ型膠原mRNA與蛋白水平表達(dá)的影響。結(jié)果表明MMPs激動(dòng)劑引起MMP-1/2活性顯著增加,Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)下降,MMPs抑制劑引起MMP-1/2活性顯著下降,相應(yīng)的Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)增加。盡管數(shù)據(jù)提示MMP-1抑制劑并未引起MMP-1 mRNA表達(dá)的明顯下降,但MMP-1活性明顯下降,MMP-1蛋白表達(dá)減少,鞏膜成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA和蛋白原表達(dá)均增高;類似的,激動(dòng)劑APMA并未引起MMP-2 mRNA表達(dá)的增加,但是MMP-2活性增強(qiáng),其蛋白表達(dá)增加,導(dǎo)致Ⅰ型膠原mRNA和蛋白原表達(dá)均下降。由此可見,MMP-1/2激動(dòng)劑或抑制劑可引起MMP-1/2活性的改變,伴隨相應(yīng)蛋白表達(dá)的改變,最終影響鞏膜成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原的表達(dá)。其中,MMP-1/2mRNA表達(dá)的變化并不是最關(guān)鍵的因素,而其具有活性成分蛋白表達(dá)的改變才是最終引起Ⅰ型膠原表達(dá)改變的關(guān)鍵因素。

    在應(yīng)用siRNA干擾方法敲除MMP-1、MMP-2或同時(shí)兩者均敲除后,MMP-1蛋白表達(dá)均顯著降低,MMP-2除在MMP-1siRNA干擾敲除組無(wú)明顯變化外,其余各組均顯著下降。用siRNA敲除MMP-1/MMP-2,類似于MMP-1/MMP-2被抑制,Ⅰ型膠原的表達(dá)在各敲除組中顯著增加。當(dāng)MMP-1和MMP-2均干擾敲除時(shí),Ⅰ型膠原的表達(dá)增加最為顯著。由此可見,MMP-1和MMP-2在鞏膜Ⅰ型膠原表達(dá)變化中起關(guān)鍵作用,且兩者之間具有協(xié)同作用。

    綜上所述,本研究表明,在人鞏膜成纖維細(xì)胞系中,MMP-1和MMP-2是調(diào)控鞏膜Ⅰ型膠原重塑的關(guān)鍵因子,而鞏膜重塑是近視眼眼軸延長(zhǎng)的重要機(jī)制之一,本研究為今后通過(guò)藥物干預(yù)鞏膜膠原重塑過(guò)程來(lái)防治近視提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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    Effect of agonists and inhibitors ofmatrix metalloproteinases on expression ofmatrix metalloproteinase 1/2 and collagen I in human scleral fibroblast

    ZOU Lei-lei,LIU Rui,LIU Hong,HUANG Li-wen,ZHOU Xing-tao,ZHOU Hao.Departmentof Ophthalmology,Eye Ear Nose and Throat Hospitalof Fudan University,Shanghai 200031,China Corresponding author:LIU Hong,Email:liuhongzef@263.net

    ObjectiveTo investigate the effect of agonist and inhibitor ofmatrixmetalloproteinase-1(MMP-1)and MMP-2 in matrix metalloproteinases(MMPs)on the expression of typeⅠcollagen and the effect of MMP-1 and MMP-2 in the development of human scleral collagen.Methods Human scleral fibroblast line was established as a model.Fluorescent quantitative assay was used to investigate the effect of P-aminophenylmercuric acetate(APMA)and inhibitors of MMP-1 and MMP-2 on MMP-1 and MMP-2 in human scleral fibroblast.Real-time PCR(RT-PCR)and Western-blotwere used to compare the expression ofmRNA and protein levels ofMMP-1、MMP-2 and typeⅠcollagen after exposure to APMA and inhibitors of MMP-1/2.Finally,Gene of MMP-1 or MMP-2 or both were knocked out with small interfering RNA(siRNA)and the expression of typeⅠcollagen was detected.Results APMA significantly improved the activity of MMP-1/2 and decreased the expression of typeⅠcollagen on both mRNA and protein levels(P<0.01);inhibitors of MMPs decreased the activity of MMP-1/2 and increased the expression typeⅠcollagen on both mRNA and protein levels(P<0.01).APMA increased the expression ofmRNA in MMP-1(P<0.01)but not MMP-2(P>0.05).When gene of MMP-1 or MMP-2 or both were knocked out with siRNA,the protein levels of MMP-1 were significantly decreased(P<0.01);MMP-2 were also significantly decreased(P<0.01)except in the MMP-1 knockdown group(P>0.05);TypeⅠcollagen were significantly increased(P<0.01)especially when the MMP-1 and MMP-2 were both knocked out.Conclusions In human scleral fibroblast line,both agonistand inhibitor could change the activity and the protein level of MMP-1 and MMP-2 and finally change the expression of typeⅠcollagen.MMP-1 and MMP-2 were key factors in rebuilding of typeⅠcollagen in human sclera.(Chin JOphthalmol and Otorhinolaryngol,2013,13:91-95)

    Human scleral fibroblast;Matrixmetalloproteinase 1;Matrixmetalloproteinase 2;Collagen,typeⅠ

    2012-12-03)

    (本文編輯 諸靜英)

    國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(81100689);上海市科技人才計(jì)劃項(xiàng)目(09PJ1402400)

    復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031

    劉紅(Email:liuhongzef@263.net)

    鄒蕾蕾、劉睿同為第一作者

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