穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3對喉癌Hep－2細(xì)胞侵襲性的影響

孫紅村 郭明麗 王俊閣 張建耀

研究［1-2］證實(shí)，體內(nèi)絕大多數(shù)腫瘤組織中都有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)的異?；罨?，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、呼吸道腫瘤、消化道腫瘤、乳腺癌、黑色素瘤、皮膚癌及頭頸部腫瘤等。由于細(xì)胞外的配體與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路得以激活，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的增殖和侵襲［3］。實(shí)驗［4］發(fā)現(xiàn)，STAT3 在喉癌中的表達(dá)與臨床分期、分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯關(guān)系。前期實(shí)驗我們成功篩選出了穩(wěn)定表達(dá)siRNA-STAT3的Hep-2細(xì)胞系［5］。本實(shí)驗在此基礎(chǔ)上將觀察STAT3被抑制后Hep-2細(xì)胞侵襲性的變化及下游細(xì)胞外基質(zhì)黏附分子-1(intercelluar adhesion molecule 1，ICAM-1)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的表達(dá)，探討其可能的侵襲機(jī)制，為臨床通過基因沉默技術(shù)治療喉癌提供實(shí)驗支持和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料及儀器 喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2(美國國家癌癥研究所病理實(shí)驗室提供，白求恩國際和平醫(yī)院保存)，RPMI 1640培養(yǎng)基 (Gibco公司，美國)，HRP-山羊抗鼠 IgG和 ICAM-1、VEGF鼠抗人單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)，細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司，美國)，Matrigel膠(B.D.公司，美國)，Transwell小室(Corning公司，美國)，光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本)，Leica B6120溫箱(Heraeus公司，德國)，熒光倒置顯微鏡(Leica公司，德國)。STAT3(2144-2162)正義鏈序列為5'-CACCGCAGCAGCTGAACAACATGTTCA AGAGACATGTTGTTCAGCTGCTGCTTTTTTG-3'，反 義鏈5'-GATCCAAAAAAGCAGCAGCTGAACAACATGTCT CTTGAACATGTTGTTCAGCTGCTGC-3'。同時設(shè)陰性對照 shNC，其序列如下:正義鏈 5'-CACCGTT CTCCGAACGTTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTT CGGAGAATTTTTTG-3'，反 義 鏈 5-GATCCAAAAAAT TCTCCGAACGTGTCCGTAATCTCTTGACGTGACACGTT CGGAGAAC-3'。

1.2 研究分組 研究分為3組:①空白對照組;②重組siRNA-STAT3質(zhì)粒組;③重組siRNA-shNC組(無關(guān)質(zhì)粒)。

1.3 細(xì)胞黏附實(shí)驗 用無血清RPMI1640培養(yǎng)基按3∶1比例稀釋Matrigel膠。96孔培養(yǎng)板中加入Matrigel膠稀釋液及細(xì)胞。先行MTT比色法檢測黏附細(xì)胞吸光值:37℃孵育20、40、60min后，吸出未黏附細(xì)胞，每孔添加新鮮培養(yǎng)基及MTT液(5mg/mL)及DMSO。測定各孔細(xì)胞在490 nm波長處的吸光值(A值)。檢測總細(xì)胞吸光值:各組細(xì)胞37℃孵育4 h后，每孔直接添加等量MTT，余同前操作。細(xì)胞黏附率(%)=(黏附細(xì)胞A值/總細(xì)胞A值)×100%。

1.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗 接種細(xì)胞于96孔板中培養(yǎng)24 h。用移液器槍頭(10 μL)沿培養(yǎng)孔底部呈“│”形劃痕;用無血清培養(yǎng)液洗滌，更換含1%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再換用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。觀察劃痕區(qū)細(xì)胞遷移情況并照相。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗 稀釋Matrigel膠(1∶3)。Transwell上室加入細(xì)胞和無血清RPMI1640培養(yǎng)基，下室加入含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。取出上室，擦去Matrigel凝膠和聚碳酯膜上表面的細(xì)胞。甲醇固定，行蘇木精染色。取下聚碳酯膜，將有細(xì)胞的一面置于載玻片上，高倍鏡下(×200)觀察視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。

1.6 Western印跡法檢測ICAM-1和VEGF蛋白的表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。轉(zhuǎn)膜時，設(shè)置 ICAM-1和VEGF抗體轉(zhuǎn)膜條件為350 mA，1.5 h。分別加入ICAM-1和VEGF抗體及HRP標(biāo)記的二抗，最后顯影及定影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel軟件整理，應(yīng)用SPSS 11.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;3組均數(shù)的比較用ANVOA方差分析;組間比較和兩因素比較采用t檢驗;P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測各組細(xì)胞的黏附能力 應(yīng)用MTT測定細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)上的黏附性呈現(xiàn)一定的時間-效應(yīng)關(guān)系:接種細(xì)胞20min后觀察各組細(xì)胞的黏附率相差不大(P＞0.05)，40min后 siRNA-STAT3組的黏附率小于 siRNA-shNC組和空白對照組(P＜0.05)，STAT3被抑制后黏附抑制效應(yīng)在60min后更加明顯(P ＜0.05)(表 1)。

表1 各組細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)上的黏附率()

表1 各組細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)上的黏附率()

細(xì)胞接種時間(min)n 黏附率(%)siRNA-STAT3 siRNA-shNC F值 P值空白組20 5 49.62 ±3.84 50.58 ±3.38 51.06 ±3.87 0.124 0.88640 5 75.90 ±2.20 83.06 ±5.51 86.96 ±5.04 8.063 0.02060 5 82.38 ±1.76 93.60 ±1.93 93.94 ±2.35 12.5270.012

2.2 細(xì)胞劃痕法檢測各組細(xì)胞的遷移能力 接種培養(yǎng)板48 h后，熒光顯微鏡下見空白組和siRNA-shNC組的Hep-2細(xì)胞向劃痕區(qū)生長速度明顯快于siRNASTAT3組，而空白組和siRNA-shNC組的Hep-2細(xì)胞向劃痕區(qū)生長速度基本一致(圖1)。

2.3 Transwell法檢測各組細(xì)胞的侵襲能力 以細(xì)胞穿過Matrigel基質(zhì)的能力量化其侵襲能力。本實(shí)驗各組細(xì)胞接種Transwell小室24 h后，siRNA-STAT3組穿至濾膜下面的細(xì)胞數(shù)明顯低于空白對照組和siRNA-shNC組(圖2)。

圖1.接種培養(yǎng)板48 h后各組細(xì)胞的遷移變化(10×20)

圖2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA-STAT3對Hep-2侵襲能力的影響(蘇木精染色，10×20)

2.4 Western印跡 結(jié)果顯示，siRNA-STAT3組VEGF和ICAM-1蛋白的表達(dá)量均低于空白組和siRNA-shNC組(圖3)。

圖3.ICAM-1，VEGF表達(dá)量的變化

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特性之一，也是目前治療效果較差的原因之一。STAT3信號傳導(dǎo)通路參與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。人類黑色素瘤中STAT3的異常表達(dá)能顯著提高癌細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移的機(jī)會［6］，說明活化的STAT3對腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移起著重要作用。Dien等［7］證實(shí)了p-STAT3在有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中存在高表達(dá)，提示STAT3的異常激活可能與乳腺癌的細(xì)胞侵襲性有關(guān)。有實(shí)驗［4］表明，STAT3與喉癌的侵襲也呈正相關(guān)。

腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附在其侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著極為重要的作用。由于Matrigel膠經(jīng)重建后能在聚碳酸濾膜表面形成類似天然基底膜的結(jié)構(gòu)，借助Matrigel膠通過 MTT法觀察黏附的細(xì)胞數(shù)能模擬Hep-2細(xì)胞的黏附能力。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，隨著接種培養(yǎng)板的時間延長，siRNA-STAT3組Hep-2細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附率逐漸下降。說明STAT3基因表達(dá)被沉默后，Hep-2細(xì)胞在人工基質(zhì)上的黏附力下降，提示STAT3基因能夠釋放出某種信號，以增加相關(guān)黏附蛋白的表達(dá)，使喉癌細(xì)胞群擴(kuò)散，并不斷與細(xì)胞外基質(zhì)接觸和黏附，進(jìn)而打開侵襲的大門。ICAM-1作為黏附蛋白已被證實(shí)在腫瘤中存在著高表達(dá)，其作用與腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移明顯相關(guān)［8-9］。而且本實(shí)驗在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA-STAT3的細(xì)胞中檢測到ICAM-1的表達(dá)下降，說明ICAM-1在喉癌細(xì)胞黏附細(xì)胞外基質(zhì)中起著重要作用。另外，ICAM-1高表達(dá)的細(xì)胞更易出現(xiàn)血行轉(zhuǎn)移，這是因為ICAM-1能使已入血的腫瘤細(xì)胞順利黏附到血管內(nèi)皮細(xì)胞上［10］。

由于喉癌侵襲以局部浸潤為主，所以需具備一定的運(yùn)動能力，才能到達(dá)相鄰正常組織。為了證實(shí)STAT3信號通路與喉癌Hep-2細(xì)胞的遷移關(guān)系，通過劃痕實(shí)驗發(fā)現(xiàn)接種培養(yǎng)板48 h后，siRNA-STAT3組的Hep-2細(xì)胞向劃痕區(qū)生長速度明顯落后于空白對照組和shNC組，表明激活的STAT3能增強(qiáng)Hep-2細(xì)胞的運(yùn)動能力。由于喉癌細(xì)胞遷移伴隨著侵襲的整個過程，整個遷移過程中STAT3信號通路到底發(fā)揮多大作用也決定著喉癌的侵襲能力。腫瘤的遷移模式分為阿米巴式遷移和間充質(zhì)式遷移。當(dāng)上皮細(xì)胞可塑性變化時，這兩種模式可相互轉(zhuǎn)變［11］。

喉癌侵襲和轉(zhuǎn)移最關(guān)鍵的一步就是黏附并降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。ECM包括膠原、纖黏蛋白及層黏蛋白等。腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落后，入侵到ECM，與基底膜和細(xì)胞間質(zhì)中一些分子黏附，通過分泌各種降解酶，協(xié)助腫瘤細(xì)胞穿過ECM進(jìn)入血管。Transwell小室和Matrigel膠可以模擬細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。我們在實(shí)驗中觀察到，STAT3干擾組穿過基質(zhì)和濾膜喉癌Hep-2細(xì)胞數(shù)明顯低于其他兩組，說明STAT3的表達(dá)被抑制后，Hep-2細(xì)胞侵襲能力下降，提示STAT3信號通路能增強(qiáng)喉癌細(xì)胞降解基質(zhì)的能力來增強(qiáng)其侵襲性，以便其能更好地向周圍正常組織擴(kuò)散和生長。

癌細(xì)胞的血管生成作用作為侵襲的終末環(huán)節(jié)，能體現(xiàn)惡性腫瘤的侵襲力，其中VEGF蛋白的表達(dá)對腫瘤侵襲的影響至關(guān)重要。由于它能顯著促進(jìn)原發(fā)瘤的生長和轉(zhuǎn)移，故其生物學(xué)特征影響著腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)后［12］。本實(shí)驗觀察到STAT3表達(dá)被抑制后 VEGF的表達(dá)明顯下降，推測Hep-2細(xì)胞侵襲力的下降與VEGF表達(dá)下降有關(guān)。

喉癌Hep-2細(xì)胞的黏附、遷移、降解基質(zhì)及血管生成作用的能力均伴隨著侵襲的整個過程，各個環(huán)節(jié)又相互作用，相互影響。STAT3信號通路的激活能夠影響喉癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，從根本上說與相關(guān)蛋白的活性增強(qiáng)或表達(dá)增加有關(guān)。總結(jié)本次實(shí)驗，我們認(rèn)為VEGF和ICAM-1作為兩個特征性蛋白的高表達(dá)共同參與了STAT3信號通路對喉癌Hep-2細(xì)胞的調(diào)控。它們表達(dá)的高低直接影響Hep-2細(xì)胞的黏附、遷移、降解基質(zhì)及血管生成的作用。

總之，我們發(fā)現(xiàn)STAT3能提高喉癌細(xì)胞的黏附、遷移、降解基質(zhì)及血管生成能力，其機(jī)制可能與ICAM-1和VEGF的表達(dá)有關(guān)。另外本實(shí)驗也提示我們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默STAT3的表達(dá)能顯著抑制喉癌細(xì)胞的侵襲性。但由于STAT3信號通路的調(diào)控非常復(fù)雜，對STAT3作用于喉癌細(xì)胞的侵襲機(jī)制的研究仍需不斷深入。

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