穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3對(duì)喉癌Hep－2細(xì)胞侵襲性的影響

孫紅村 郭明麗 王俊閣 張建耀

研究［1-2］證實(shí)，體內(nèi)絕大多數(shù)腫瘤組織中都有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)的異?；罨缰袠猩窠?jīng)系統(tǒng)腫瘤、呼吸道腫瘤、消化道腫瘤、乳腺癌、黑色素瘤、皮膚癌及頭頸部腫瘤等。由于細(xì)胞外的配體與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路得以激活，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的增殖和侵襲［3］。實(shí)驗(yàn)［4］發(fā)現(xiàn)，STAT3 在喉癌中的表達(dá)與臨床分期、分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯關(guān)系。前期實(shí)驗(yàn)我們成功篩選出了穩(wěn)定表達(dá)siRNA-STAT3的Hep-2細(xì)胞系［5］。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上將觀察STAT3被抑制后Hep-2細(xì)胞侵襲性的變化及下游細(xì)胞外基質(zhì)黏附分子-1(intercelluar adhesion molecule 1，ICAM-1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的表達(dá)，探討其可能的侵襲機(jī)制，為臨床通過(guò)基因沉默技術(shù)治療喉癌提供實(shí)驗(yàn)支持和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料及儀器 喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2(美國(guó)國(guó)家癌癥研究所病理實(shí)驗(yàn)室提供，白求恩國(guó)際和平醫(yī)院保存)，RPMI 1640培養(yǎng)基 (Gibco公司，美國(guó))，HRP-山羊抗鼠 IgG和 ICAM-1、VEGF鼠抗人單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國(guó))，細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司，美國(guó))，Matrigel膠(B.D.公司，美國(guó))，Transwell小室(Corning公司，美國(guó))，光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本)，Leica B6120溫箱(Heraeus公司，德國(guó))，熒光倒置顯微鏡(Leica公司，德國(guó))。STAT3(2144-2162)正義鏈序列為5'-CACCGCAGCAGCTGAACAACATGTTCA AGAGACATGTTGTTCAGCTGCTGCTTTTTTG-3'，反 義鏈5'-GATCCAAAAAAGCAGCAGCTGAACAACATGTCT CTTGAACATGTTGTTCAGCTGCTGC-3'。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照 shNC，其序列如下:正義鏈 5'-CACCGTT CTCCGAACGTTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTT CGGAGAATTTTTTG-3'，反 義 鏈 5-GATCCAAAAAAT TCTCCGAACGTGTCCGTAATCTCTTGACGTGACACGTT CGGAGAAC-3'。

1.2 研究分組 研究分為3組:①空白對(duì)照組;②重組siRNA-STAT3質(zhì)粒組;③重組siRNA-shNC組(無(wú)關(guān)質(zhì)粒)。

1.3 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基按3∶1比例稀釋Matrigel膠。96孔培養(yǎng)板中加入Matrigel膠稀釋液及細(xì)胞。先行MTT比色法檢測(cè)黏附細(xì)胞吸光值:37℃孵育20、40、60min后，吸出未黏附細(xì)胞，每孔添加新鮮培養(yǎng)基及MTT液(5mg/mL)及DMSO。測(cè)定各孔細(xì)胞在490 nm波長(zhǎng)處的吸光值(A值)。檢測(cè)總細(xì)胞吸光值:各組細(xì)胞37℃孵育4 h后，每孔直接添加等量MTT，余同前操作。細(xì)胞黏附率(%)=(黏附細(xì)胞A值/總細(xì)胞A值)×100%。

1.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 接種細(xì)胞于96孔板中培養(yǎng)24 h。用移液器槍頭(10 μL)沿培養(yǎng)孔底部呈“│”形劃痕;用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌，更換含1%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再換用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。觀察劃痕區(qū)細(xì)胞遷移情況并照相。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 稀釋Matrigel膠(1∶3)。Transwell上室加入細(xì)胞和無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基，下室加入含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。取出上室，擦去Matrigel凝膠和聚碳酯膜上表面的細(xì)胞。甲醇固定，行蘇木精染色。取下聚碳酯膜，將有細(xì)胞的一面置于載玻片上，高倍鏡下(×200)觀察視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。

1.6 Western印跡法檢測(cè)ICAM-1和VEGF蛋白的表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。轉(zhuǎn)膜時(shí)，設(shè)置 ICAM-1和VEGF抗體轉(zhuǎn)膜條件為350 mA，1.5 h。分別加入ICAM-1和VEGF抗體及HRP標(biāo)記的二抗，最后顯影及定影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel軟件整理，應(yīng)用SPSS 11.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;3組均數(shù)的比較用ANVOA方差分析;組間比較和兩因素比較采用t檢驗(yàn);P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的黏附能力 應(yīng)用MTT測(cè)定細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)上的黏附性呈現(xiàn)一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系:接種細(xì)胞20min后觀察各組細(xì)胞的黏附率相差不大(P＞0.05)，40min后 siRNA-STAT3組的黏附率小于 siRNA-shNC組和空白對(duì)照組(P＜0.05)，STAT3被抑制后黏附抑制效應(yīng)在60min后更加明顯(P ＜0.05)(表 1)。

表1 各組細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)上的黏附率()

表1 各組細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)上的黏附率()

細(xì)胞接種時(shí)間(min)n 黏附率(%)siRNA-STAT3 siRNA-shNC F值 P值空白組20 5 49.62 ±3.84 50.58 ±3.38 51.06 ±3.87 0.124 0.88640 5 75.90 ±2.20 83.06 ±5.51 86.96 ±5.04 8.063 0.02060 5 82.38 ±1.76 93.60 ±1.93 93.94 ±2.35 12.5270.012

2.2 細(xì)胞劃痕法檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力 接種培養(yǎng)板48 h后，熒光顯微鏡下見(jiàn)空白組和siRNA-shNC組的Hep-2細(xì)胞向劃痕區(qū)生長(zhǎng)速度明顯快于siRNASTAT3組，而空白組和siRNA-shNC組的Hep-2細(xì)胞向劃痕區(qū)生長(zhǎng)速度基本一致(圖1)。

2.3 Transwell法檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力 以細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)的能力量化其侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞接種Transwell小室24 h后，siRNA-STAT3組穿至濾膜下面的細(xì)胞數(shù)明顯低于空白對(duì)照組和siRNA-shNC組(圖2)。

圖1.接種培養(yǎng)板48 h后各組細(xì)胞的遷移變化(10×20)

圖2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA-STAT3對(duì)Hep-2侵襲能力的影響(蘇木精染色，10×20)

2.4 Western印跡 結(jié)果顯示，siRNA-STAT3組VEGF和ICAM-1蛋白的表達(dá)量均低于空白組和siRNA-shNC組(圖3)。

圖3.ICAM-1，VEGF表達(dá)量的變化

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特性之一，也是目前治療效果較差的原因之一。STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路參與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。人類(lèi)黑色素瘤中STAT3的異常表達(dá)能顯著提高癌細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)［6］，說(shuō)明活化的STAT3對(duì)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移起著重要作用。Dien等［7］證實(shí)了p-STAT3在有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中存在高表達(dá)，提示STAT3的異常激活可能與乳腺癌的細(xì)胞侵襲性有關(guān)。有實(shí)驗(yàn)［4］表明，STAT3與喉癌的侵襲也呈正相關(guān)。

腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附在其侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著極為重要的作用。由于Matrigel膠經(jīng)重建后能在聚碳酸濾膜表面形成類(lèi)似天然基底膜的結(jié)構(gòu)，借助Matrigel膠通過(guò) MTT法觀察黏附的細(xì)胞數(shù)能模擬Hep-2細(xì)胞的黏附能力。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著接種培養(yǎng)板的時(shí)間延長(zhǎng)，siRNA-STAT3組Hep-2細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附率逐漸下降。說(shuō)明STAT3基因表達(dá)被沉默后，Hep-2細(xì)胞在人工基質(zhì)上的黏附力下降，提示STAT3基因能夠釋放出某種信號(hào)，以增加相關(guān)黏附蛋白的表達(dá)，使喉癌細(xì)胞群擴(kuò)散，并不斷與細(xì)胞外基質(zhì)接觸和黏附，進(jìn)而打開(kāi)侵襲的大門(mén)。ICAM-1作為黏附蛋白已被證實(shí)在腫瘤中存在著高表達(dá)，其作用與腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移明顯相關(guān)［8-9］。而且本實(shí)驗(yàn)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA-STAT3的細(xì)胞中檢測(cè)到ICAM-1的表達(dá)下降，說(shuō)明ICAM-1在喉癌細(xì)胞黏附細(xì)胞外基質(zhì)中起著重要作用。另外，ICAM-1高表達(dá)的細(xì)胞更易出現(xiàn)血行轉(zhuǎn)移，這是因?yàn)镮CAM-1能使已入血的腫瘤細(xì)胞順利黏附到血管內(nèi)皮細(xì)胞上［10］。

由于喉癌侵襲以局部浸潤(rùn)為主，所以需具備一定的運(yùn)動(dòng)能力，才能到達(dá)相鄰正常組織。為了證實(shí)STAT3信號(hào)通路與喉癌Hep-2細(xì)胞的遷移關(guān)系，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種培養(yǎng)板48 h后，siRNA-STAT3組的Hep-2細(xì)胞向劃痕區(qū)生長(zhǎng)速度明顯落后于空白對(duì)照組和shNC組，表明激活的STAT3能增強(qiáng)Hep-2細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。由于喉癌細(xì)胞遷移伴隨著侵襲的整個(gè)過(guò)程，整個(gè)遷移過(guò)程中STAT3信號(hào)通路到底發(fā)揮多大作用也決定著喉癌的侵襲能力。腫瘤的遷移模式分為阿米巴式遷移和間充質(zhì)式遷移。當(dāng)上皮細(xì)胞可塑性變化時(shí)，這兩種模式可相互轉(zhuǎn)變［11］。

喉癌侵襲和轉(zhuǎn)移最關(guān)鍵的一步就是黏附并降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。ECM包括膠原、纖黏蛋白及層黏蛋白等。腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落后，入侵到ECM，與基底膜和細(xì)胞間質(zhì)中一些分子黏附，通過(guò)分泌各種降解酶，協(xié)助腫瘤細(xì)胞穿過(guò)ECM進(jìn)入血管。Transwell小室和Matrigel膠可以模擬細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到，STAT3干擾組穿過(guò)基質(zhì)和濾膜喉癌Hep-2細(xì)胞數(shù)明顯低于其他兩組，說(shuō)明STAT3的表達(dá)被抑制后，Hep-2細(xì)胞侵襲能力下降，提示STAT3信號(hào)通路能增強(qiáng)喉癌細(xì)胞降解基質(zhì)的能力來(lái)增強(qiáng)其侵襲性，以便其能更好地向周?chē)＝M織擴(kuò)散和生長(zhǎng)。

癌細(xì)胞的血管生成作用作為侵襲的終末環(huán)節(jié)，能體現(xiàn)惡性腫瘤的侵襲力，其中VEGF蛋白的表達(dá)對(duì)腫瘤侵襲的影響至關(guān)重要。由于它能顯著促進(jìn)原發(fā)瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，故其生物學(xué)特征影響著腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)后［12］。本實(shí)驗(yàn)觀察到STAT3表達(dá)被抑制后 VEGF的表達(dá)明顯下降，推測(cè)Hep-2細(xì)胞侵襲力的下降與VEGF表達(dá)下降有關(guān)。

喉癌Hep-2細(xì)胞的黏附、遷移、降解基質(zhì)及血管生成作用的能力均伴隨著侵襲的整個(gè)過(guò)程，各個(gè)環(huán)節(jié)又相互作用，相互影響。STAT3信號(hào)通路的激活能夠影響喉癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，從根本上說(shuō)與相關(guān)蛋白的活性增強(qiáng)或表達(dá)增加有關(guān)。總結(jié)本次實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為VEGF和ICAM-1作為兩個(gè)特征性蛋白的高表達(dá)共同參與了STAT3信號(hào)通路對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞的調(diào)控。它們表達(dá)的高低直接影響Hep-2細(xì)胞的黏附、遷移、降解基質(zhì)及血管生成的作用。

總之，我們發(fā)現(xiàn)STAT3能提高喉癌細(xì)胞的黏附、遷移、降解基質(zhì)及血管生成能力，其機(jī)制可能與ICAM-1和VEGF的表達(dá)有關(guān)。另外本實(shí)驗(yàn)也提示我們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默STAT3的表達(dá)能顯著抑制喉癌細(xì)胞的侵襲性。但由于STAT3信號(hào)通路的調(diào)控非常復(fù)雜，對(duì)STAT3作用于喉癌細(xì)胞的侵襲機(jī)制的研究仍需不斷深入。

［1］Masuda M，Wakasaki T，Suzui M，et al.STAT3 orchestrates tumor development and progression:the Achilles＇heel of head and neck cancers?［J］.Curr Cancer Drug Targets，2010，10(1):117-126.

［2］Johnston PA，Grandis JR.STAT3 SIGNALING:anticancer strategies and challenges［J］.Mol Interv，2011，11(1):18-26.

［3］Ghoshal GS，Baumann H，Wetzler M.Epigenetic regulation of signal transducer and activator of transcription 3 in acute myeloid leukemia［J］.Leuk Res，2008，32(7):1005-1014.

［4］王俊閣，李曉明，路秀英，等.STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路在喉癌中的表達(dá)及意義［J］.中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科，2009，16(3):115-118.

［5］孫紅村，王俊閣，皮麗宏，等.穩(wěn)定表達(dá)siRNA-STAT3基因Hep-2細(xì)胞系的建立［J］.中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科，2010，17(8):399-402.

［6］Lee I，F(xiàn)ox PS，F(xiàn)erguson SD，et al.The expression of p-STAT3 in stage IV melanoma:risk of CNS metastasis and survival［J］.Oncotarget，2012，3(3):336-44.

［7］Dien J，Amin HM，Chiu N，et al.Signal transducers and acti-vators of transcription 3 up-regulates tissue inhibitor of metallo-proteinase-1 expression and decreases invasiveness of breast cancer［J］.Am J Pathol，2006，169(2):633-642.

［8］Hayes SH，Seigel GM.Immunoreactivity of ICAM-1 in human tumors，metastases and normal tissues［J］.Int J Clin Exp Pathol，2009，2(6):553-560.

［9］Gogali A，Charalabopoulos K，Zampira I.Soluble adhesion molecules E-cadherin，intercellular adhesion molecule-1，and E-selectin as lung cancer biomarkers［J］.Chest，2010，138(5):1173-1179.

［10］Dymicka PV，Kemona H.Does colorectal cancer clinical advancement affect adhesion molecules(sP-selectin，sE-selectin and ICAM-1)concentration?［J］.Thromb Res，2009，124(1):80-83.

［11］Van ZF，Krupitza G，Mikulits W.Initial steps of metastasis:cell invasion and endothelial transmigration［J］.Mutat Res，2011，728(1/2):23-34.

［12］Ghosh S，Sullivan CA，Zerkowski MP，et al.High levels of vascular endothelial growth factor and its receptors(VEGFR-1，VEGFR-2，neuropilin-1)are associated with worse outcome in breast cancer［J］.Hum Pathol，2008，39(12):1835-1843.