葉面噴施矮壯素對(duì)番茄嫁接愈合的調(diào)節(jié)作用

孟憲敏，張 鋒，段韞丹，董春娟，張夢(mèng)夏，尚慶茂

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

番茄(LycopersiconesculentumMiller.)屬于茄科番茄亞屬，全世界廣泛栽培的蔬菜作物之一，據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)，2019年總產(chǎn)量1.81億t，種植面積503萬(wàn)hm2，總產(chǎn)值860.66億美元(www.fao.org)。隨著設(shè)施番茄栽培面積不斷擴(kuò)大，土壤連作障害日趨嚴(yán)重，其品質(zhì)、產(chǎn)量和效益下降[1]。嫁接作為實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)對(duì)土傳病害的栽培技術(shù)，逐年運(yùn)用到蔬菜生產(chǎn)上，特別是屬間嫁接親和的葫蘆科和茄科作物[2-3]。嫁接可有效克服作物根結(jié)線蟲等土傳病害[4]，提高作物疫霉病與青枯病抗性[5]以及高溫或鹽脅迫的耐受性[6-8]，從而提高作物品質(zhì)和產(chǎn)量[9-11]，成為高效且環(huán)境友好型農(nóng)業(yè)技術(shù)之一。

嫁接愈合進(jìn)程涉及砧穗組織黏連、隔離層形成和消失、愈傷組織形成以及維管束重連等一系列事件，受砧穗內(nèi)在遺傳物質(zhì)和外在環(huán)境雙重影響[12-14]，核心是多種激素信號(hào)共同參與嫁接體形成。在番茄嫁接愈合進(jìn)程中，生長(zhǎng)素(IAA)和細(xì)胞分裂素(CTK)對(duì)嫁接接合部愈傷組織形成和維管束重連起主導(dǎo)作用[15]。Lu等[16]在黃瓜試管苗離體莖段嫁接時(shí)施加IAA和玉米素(ZT)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IAA和ZT是砧穗維管束橋分化的必要條件。外施生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(TIBA)于擬南芥子葉，抑制了下胚軸嫁接接合部維管束形成和細(xì)胞增殖[13]。當(dāng)植物遭受創(chuàng)傷后，誘導(dǎo)脫分化基因WIND1(wound induced dedifferentiation1)表達(dá)，激活中柱鞘和創(chuàng)傷部位細(xì)胞中B類響應(yīng)因子ARR(arabidopsis response regulator)介導(dǎo)的CTK信號(hào)，刺激CTK含量升高，促進(jìn)創(chuàng)傷面形成愈傷組織[17-18]。

在實(shí)際生產(chǎn)中，尤其是夏季育苗過(guò)程中，常通過(guò)葉面噴施矮壯素(CCC)控制幼苗徒長(zhǎng)，調(diào)控番茄株型，更便于嫁接，降低育苗成本。CCC主要抑制赤霉素(GA)合成途徑中內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶(KS)活性，其活性催化香葉基焦磷酸酯(GGPP)轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)根-貝殼杉烯。外源噴施CCC可降低GA含量，提高IAA含量，進(jìn)而增加作物莖葉生物量[19]。Wang等[20]對(duì)馬鈴薯的研究也發(fā)現(xiàn)外源CCC可顯著提高IAA和玉米素(Z)的含量，馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)隨之提高。在番茄嫁接前育苗期葉面噴施CCC，是否會(huì)影響嫁接愈合進(jìn)程，迄今還鮮見(jiàn)有研究報(bào)道。因此，本研究在番茄嫁接前葉面噴施CCC，考察外源CCC對(duì)幼苗生長(zhǎng)和嫁接接合部植物激素含量的影響，比較愈合進(jìn)程中維管束重構(gòu)的差異，以期為番茄嫁接生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與培養(yǎng)

試驗(yàn)于2020年6月至2021年6月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所玻璃溫室(39°97′N，116°34′E)進(jìn)行。試驗(yàn)材料為番茄(LycopersiconesculentumMiller.)接穗品種‘硬粉8號(hào)’和砧木品種‘砧愛(ài)1號(hào)’，均購(gòu)自京研益農(nóng)(北京)種業(yè)科技有限公司。

挑選籽粒飽滿番茄種子，室溫浸種6 h，1.0% NaClO消毒5 min，蒸餾水沖洗數(shù)次，28 ℃催芽。選取發(fā)芽一致的種子播于裝有混合基質(zhì)[草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1(V/V)]的72孔穴盤，播種深度1.5 cm，覆蓋蛭石，每盤灌水約1 L，置玻璃溫室自然溫光條件下生長(zhǎng)，晝/夜平均溫度分別為(27 ± 3)℃/(18 ± 2)℃，自然光照強(qiáng)度約650 μmol·m-2·s-1，空氣相對(duì)濕度75%～85%。幼苗子葉平展后，每隔3 d灌溉0.5 g·L-1水溶肥(上海永通化工，20-20-20-TE)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在嫁接前6和12 d，對(duì)‘硬粉8號(hào)’和‘砧愛(ài)1號(hào)’幼苗2次葉面噴施100 mL 100 mg·L-1矮壯素(CCC，有效成分98%，北京索萊寶)，并以噴施等量去離子水為對(duì)照(CK)，共2個(gè)處理。每處理48株，3次重復(fù)。

播種后27 d采用套管嫁接，使用切削器在砧木子葉上方1 cm處切取35°斜面，從頂端插入套管(2.5～3.0 mm×12 mm)，取接穗幼苗與砧木切削部位直徑相近處切取35°斜面，使砧穗切面緊密接合。愈合期置于人工氣候室(北京格潤(rùn)科爾)，條件為：嫁接后0～3 d，晝/夜溫度26 ℃/23 ℃，空氣相對(duì)濕度(98% ± 2.0%)，黑暗；嫁接后4～7 d，晝/夜溫度26 ℃/23 ℃，空氣相對(duì)濕度80%～90%，光周期12 h，光照強(qiáng)度100 μmol·m-2· s-1；嫁接后8～20 d，晝/夜溫度26 ℃/23 ℃，空氣相對(duì)濕度60%～70%，光周期12 h，光照強(qiáng)度200 μmol·m-2·s-1。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 砧穗生長(zhǎng)指標(biāo)在嫁接前測(cè)定幼苗株高、莖粗、上胚軸長(zhǎng)度和地上部干鮮重、地下部干鮮重。在嫁接后20 d，采用便攜式SPAD-502測(cè)定葉片SPAD值，采用氯化三苯基四氮唑(TTC)還原法測(cè)定根系活力[21]。每重復(fù)4株，3次重復(fù)。

1.3.2 內(nèi)源生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和赤霉素含量在嫁接后12、48和72 h，取嫁接接合部10 mm莖段(砧穗各含5 mm)，液氮速凍30 min，存于-80 ℃。取50 mg樣品加入適量?jī)?nèi)標(biāo)，用1 mL甲醇/水/甲酸(15∶4∶1，V/V/V)提取，提取液濃縮后用100 μL 80%甲醇/水溶液復(fù)溶，過(guò)0.22 μm濾膜，置于進(jìn)樣瓶，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素含量。另取50 mg樣品加入適量?jī)?nèi)標(biāo)，用500 μL乙腈水溶液提取，離心后取上清液，加入10 μL TEA和10 μL BPTAB，90 ℃反應(yīng)1 h，氮?dú)獯蹈桑?00 μL乙腈水溶液復(fù)溶，過(guò)0.22 μm濾膜，置于進(jìn)樣瓶，LC-MS/MS測(cè)定赤霉素含量[15]。每重復(fù)5株，3次重復(fù)。

植物激素含量(ng·g-1)=C×V/1 000/m，其中C為標(biāo)準(zhǔn)曲線所求濃度值(ng·mL-1)，V為復(fù)溶時(shí)所用溶液體積(μL)，m為樣品質(zhì)量(g)。

1.3.3 愈合進(jìn)程觀測(cè)在嫁接后48、72、96、120和168 h，取嫁接接合部5 mm莖段(砧穗各含2.5 mm)，每次取樣6株，3次重復(fù)。立即置于FAA固定液，抽真空后固定24 h以上，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，采用RM2245切片機(jī)(德國(guó)Leica)縱切9 μm，水浴展片后粘片，再經(jīng)脫蠟復(fù)水、番紅-固綠染色和封片，BX53熒光成像顯微鏡(DP73鏡頭，Olympus)下觀察嫁接接合部并選取視野拍照。

1.3.4 維管束連通性觀測(cè)在嫁接后48、72、96、120和168 h，于嫁接接合部上方1 cm處橫切莖段，涂抹5 μL 1 mmol·L-15-CFDA(5-羧基熒光素二乙酸酯)于切口，遮光放置7 h，在接口下方1 cm處橫切于BX53熒光成像顯微鏡(DP73鏡頭，Olympus)觀察熒光。FIJI軟件將明場(chǎng)和熒光圖片合并以及統(tǒng)計(jì)平均熒光強(qiáng)度。3次重復(fù)，每重復(fù)3株。另取嫁接苗，橫切莖基部，垂直放置于10 mL 1%酸性品紅4 h，取接合部上方全部真葉，稱重，采用德國(guó)Retsch球磨儀(MM400)研磨成勻漿，加入5 mL蒸餾水于12 000 r·min-1離心5 min，測(cè)定上清液在545 nm處吸光度，計(jì)算品紅含量。3次重復(fù)，每重復(fù)4株。另取嫁接苗，橫切莖基部后垂直放置于10 mL 1%酸性品紅40 min，徒手橫切接口上方1 cm處莖段，于SZX16體式顯微鏡(DP73鏡頭，Olympus)下觀察品紅吸收情況。3次重復(fù)，每重復(fù)3株。

品紅吸收含量(mg·g-1·h-1) =C×V×(a×W×t)-1，其中C為標(biāo)準(zhǔn)方程所求品紅含量(mg)，V為提取液總體積(mL)，a為測(cè)定所取提取液體積(mL)，W為葉片鮮重(g)，t為品紅處理時(shí)間(h)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2012整理數(shù)據(jù)和作圖，再用IBM SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCC對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)的影響

圖1和表1數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組(CK)番茄幼苗相比，嫁接前6和12 d 2次葉面噴施CCC處理的‘硬粉8號(hào)’和‘砧愛(ài)1號(hào)’幼苗株高分別顯著降低33.30%、33.96%，莖粗分別顯著降低5.31%、8.73%，同時(shí)‘硬粉8號(hào)’和‘砧愛(ài)1號(hào)’幼苗上胚軸長(zhǎng)度、地上部鮮重，以及‘砧愛(ài)1號(hào)’幼苗地上部和地下部干重也均顯著降低，而2個(gè)番茄品種幼苗的地下部鮮重均無(wú)顯著變化。說(shuō)明CCC處理顯著抑制了番茄幼苗生長(zhǎng)，砧木的表現(xiàn)尤為明顯。

表1 不同處理下番茄幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的變化Table 1 The growth of tomato seedlings under different treatments

2.2 CCC對(duì)番茄嫁接接合部愈合進(jìn)程影響

2.2.1 嫁接接合部連接過(guò)程如圖2所示，番茄嫁接接合部在嫁接后48 h受損傷形成隔離層；嫁接后72～120 h接合部薄壁細(xì)胞開始分裂增殖，繼而分化形成新的木質(zhì)部和韌皮部；嫁接后168 h維管束完成重構(gòu)。其中，嫁接前葉面噴施CCC處理的嫁接接合部于嫁接后72 h可見(jiàn)木質(zhì)部導(dǎo)管分子連接，早于對(duì)照；嫁接后96～120 h，CCC處理可明顯看到嫁接接合部木質(zhì)部導(dǎo)管分子與韌皮部基本完成連接，愈傷組織薄壁細(xì)胞互相連接，填滿接合部間隙。說(shuō)明嫁接前葉面噴施CCC處理可促進(jìn)番茄嫁接接合部細(xì)胞黏連。

2.2.2 維管束重構(gòu)過(guò)程為進(jìn)一步了解CCC處理對(duì)番茄嫁接愈合進(jìn)程中維管束重構(gòu)的影響，通過(guò)酸性品紅和CFDA經(jīng)過(guò)嫁接接合部的運(yùn)輸情況，分別顯示木質(zhì)部和韌皮部的連接情況(圖3)。CCC處理的嫁接接合部維管束品紅吸收含量多，顯著高于同期CK(圖3，Ⅰ、Ⅱ)；同時(shí)，CFDA熒光數(shù)據(jù)(圖3，Ⅲ、Ⅳ)顯示，番茄嫁接接合部下方1 cm處維管束在嫁接后96 h出現(xiàn)綠色熒光，CCC處理的平均熒光強(qiáng)度高于CK，并在嫁接后120 h差異達(dá)到顯著水平。由此可見(jiàn)，CCC處理顯著促進(jìn)了番茄幼苗嫁接愈合期接合部木質(zhì)部和韌皮部重連。

2.3 CCC對(duì)番茄嫁接接合部植物激素含量影響

由圖4可知，嫁接后12、48和72 h，葉面噴施CCC處理提高了番茄嫁接接合部L-色氨酸(TRP)、吲哚-3-乙酸甲酯(MEIAA)、色胺(TRA)和IAA含量；在嫁接后12和48 h，CCC顯著降低了嫁接接合部赤霉素GA15和GA8含量，而在嫁接后48和72 h，CCC顯著提高了嫁接接合部赤霉素GA34和GA3含量；在嫁接后12、48和72 h，CCC處理顯著提高了嫁接接合部反式-玉米素-9-B-葡萄糖苷(tZOG)和異戊烯腺嘌呤-9-葡萄糖苷(iP9G)含量，顯著降低了嫁接接合部順式-玉米素-D-核糖甙(cZR)和戊烯腺嘌呤核苷(IPR)(除嫁接后48 h)含量。因此，CCC處理促進(jìn)番茄幼苗嫁接愈合進(jìn)程中植物激素的積累，尤其是生長(zhǎng)素水平的提高，有利于嫁接接合部維管束重連。

2.4 CCC對(duì)番茄嫁接苗生長(zhǎng)影響

圖5顯示，嫁接后20 d，葉面噴施CCC處理的嫁接苗接穗葉片SPAD值和砧木根系活力分別比CK顯著提高17.49%、20.20%，說(shuō)明嫁接前葉面噴施CCC能顯著促進(jìn)嫁接苗的生長(zhǎng)發(fā)育。

3 討 論

GA通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)展在植物種子萌發(fā)和莖伸長(zhǎng)、開花和果實(shí)成熟等方面起重要作用，還可調(diào)節(jié)植物環(huán)境適應(yīng)能力[22]。矮壯素(CCC)作為GA抑制劑，廣泛用于蔬菜集約化育苗生產(chǎn)中，CCC通過(guò)抑制貝殼杉烯合酶(KS)活性，使香葉基焦磷酸酯(GGPP)合成內(nèi)根-貝殼杉烯過(guò)程受阻，抑制GA生物合成[23-24]，植株表現(xiàn)矮化，節(jié)間距縮短，葉色加深，還可增強(qiáng)植株抗逆性。外施IAA或GA3可抵消CCC處理對(duì)黃瓜下胚軸伸長(zhǎng)的抑制效果[25]。Ji等[26]研究發(fā)現(xiàn)在番茄幼苗整個(gè)生長(zhǎng)期，外施CCC處理導(dǎo)致莖和根GA合成基因表達(dá)下調(diào)，莖和根中GA含量降低，幼苗株高、下胚軸、莖粗和根長(zhǎng)降低，而GA信號(hào)基因表達(dá)模式則在莖和根中相反，導(dǎo)致根粗增加。本研究發(fā)現(xiàn)，嫁接前葉面噴施CCC處理顯著降低了番茄幼苗株高和莖粗，以及上胚軸長(zhǎng)、地上部分鮮重等，顯著抑制了番茄幼苗生長(zhǎng)，砧木的表現(xiàn)更為明顯，與前人研究結(jié)果一致。

同時(shí)，在嫁接愈合進(jìn)程中，內(nèi)源植物激素IAA、CTK和GA相互作用，能促進(jìn)細(xì)胞分化，導(dǎo)致維管束形成，接穗和砧木完成重連。據(jù)報(bào)道，在嫁接后1～3 h，創(chuàng)傷響應(yīng)誘導(dǎo)WIND1增強(qiáng)愈傷組織形成處的CTK響應(yīng)；在嫁接后3～72 h，接合部上方和下方呈非對(duì)稱表達(dá)模式，IAA和CTK分別在嫁接接合部上方和下方積累，GA在嫁接接合部上方和下方發(fā)揮作用，誘導(dǎo)愈傷組織形成和維管組織分裂；嫁接后96～240 h為恢復(fù)對(duì)稱期，木質(zhì)部和韌皮部發(fā)生重連，植株基本愈合，開始次生生長(zhǎng)[15, 27-28]。Cui 等[15]在番茄嫁接切割后，于接合面涂抹一定濃度的IAA、6-BA以及二者混合物，驗(yàn)證了IAA和CTK促進(jìn)接合部木質(zhì)部和韌皮部連接。Zhai等[29]利用根部特異性表達(dá)生長(zhǎng)素合成基因iaaM的煙草作為砧木，可提高野生型接穗IAA水平，導(dǎo)致嫁接接合部更快形成愈傷組織，加快愈合進(jìn)程；砧木中過(guò)表達(dá)生長(zhǎng)素失活基因iaaL則延緩嫁接愈合。CCC處理對(duì)植株的抑制效應(yīng)不僅是抑制GA的合成，還影響了其他內(nèi)源植物激素含量。在馬鈴薯葉面噴施CCC后，其植株葉片IAA和ZT含量顯著提高，果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)增加[23]。在本試驗(yàn)嫁接愈合進(jìn)程中，番茄幼苗葉面噴施CCC處理降低了嫁接接合部GA15和GA8含量，提高了嫁接接合部TRP、MEIAA、TRA、IAA、tZOG和iP9G含量。研究表明IAA可通過(guò)調(diào)節(jié)GA生物合成調(diào)節(jié)植株生長(zhǎng)發(fā)育，其他植物激素也可調(diào)節(jié)GA生物合成[30]。Matsuoka等[13]發(fā)現(xiàn)在擬南芥下胚軸嫁接愈合進(jìn)程中，GA含量升高，外施GA合成抑制劑多效唑(PBZ)處理可促進(jìn)維管組織細(xì)胞分裂，外施GAs或TIBA則下調(diào)了GA合成氧化酶基因GA20ox1表達(dá)，說(shuō)明IAA可通過(guò)影響GA生物合成調(diào)節(jié)維管束重連和皮層細(xì)胞擴(kuò)張。而本試驗(yàn)中，在嫁接后72 h，CCC處理還提高了嫁接接合部GA34和GA3含量，可能由于生長(zhǎng)素含量的提高而調(diào)節(jié)GA3生物合成，而GA3誘導(dǎo)蛋白酶體泛素化降解DELLA蛋白，隨之釋放光敏色素響應(yīng)因子(PIF4)誘導(dǎo)依賴TRP的IPA途徑合成IAA，促進(jìn)了嫁接接合部IAA積累?？偟膩?lái)說(shuō)，在番茄嫁接愈合進(jìn)程中，嫁接前葉面噴施CCC處理能促進(jìn)嫁接接合部生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的積累。與CK相比，嫁接前葉面噴施CCC處理的番茄嫁接成活率無(wú)差異，均為100%。本研究中，番茄嫁接后72 h，CCC處理的幼苗嫁接接合部已可見(jiàn)木質(zhì)部導(dǎo)管分子連接，早于對(duì)照；嫁接后96～120 h，CCC處理的嫁接接合部木質(zhì)部導(dǎo)管分子與韌皮部基本完成連接，愈傷組織薄壁細(xì)胞填滿接合部間隙。另外，嫁接后72～168 h，CCC處理的嫁接接合部維管束品紅吸收含量和平均熒光強(qiáng)度高于CK。綜合而言，CCC處理促進(jìn)了嫁接愈合期接合部木質(zhì)部和韌皮部重連，且促進(jìn)嫁接苗的生長(zhǎng)發(fā)育。

綜上所述，葉面噴施CCC處理抑制了番茄幼苗生長(zhǎng)，降低了番茄嫁接接合部赤霉素含量，提高了生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素含量，嫁接接合部木質(zhì)部和韌皮部連接早于對(duì)照。因此，番茄幼苗嫁接前葉面噴施CCC處理可促進(jìn)維管束重連和嫁接苗生長(zhǎng)發(fā)育。