高溫脅迫對蘿卜幼苗生長及相關(guān)基因表達(dá)的影響

周 娜，鄭 陽，陸景偉，胡 燕，陶偉林，雷開榮，潘曉雪*

(1 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所, 重慶 401329；2 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所/逆境農(nóng)業(yè)研究重慶市市級重點實驗室, 重慶 401329)

蘿卜(Raphanussativus. L)屬于十字花科蘿卜屬，是中國廣泛栽培的重要根菜類蔬菜[1]。蘿卜喜冷涼氣候，每年4～10月，大棚內(nèi)平均溫度在30 ℃以上，超過蘿卜的耐受程度，導(dǎo)致其生長勢減弱，植株根莖增長受到抑制，甚至死亡，嚴(yán)重影響了蘿卜的種植范圍和上市季節(jié)，制約了蘿卜的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)與均衡供應(yīng)[2]。因此，通過篩選耐熱性較強(qiáng)的蘿卜材料，育成優(yōu)質(zhì)耐熱蘿卜新品種是解決生產(chǎn)需求的重要途徑。

高溫不僅對植物造成明顯的外部損傷，還會影響植物體內(nèi)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、滲透調(diào)節(jié)機(jī)制、抗氧化系統(tǒng)以及光合作用等[3]。植物在長期進(jìn)化過程中可通過被動的改變來緩解高溫?zé)岷?，如積累大量的可溶性糖和脯氨酸來提高自身的滲透調(diào)節(jié)能力，從而保證植物體內(nèi)水分的充足，緩解因高溫而加劇的蒸騰作用；還可通過降低葉綠素總含量從而避免產(chǎn)生光氧化現(xiàn)象，保護(hù)光合系統(tǒng)免受損傷[4-5]。熱脅迫能引起活性氧(reactive oxygen species，ROS)類物質(zhì)H2O2的生成，激活熱激蛋白(heat shock proteins，HSP)的表達(dá)，而熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factors，HSF)能夠迅速與HSP啟動子的熱激元件(heat shock element，HSE)結(jié)合，激活下游基因的表達(dá)，從而提高植物對高溫脅迫的耐受能力[6-7]。

11162-3-1T-1是從重慶地方品種‘中壩蘿卜’材料中優(yōu)選的單株，再連續(xù)自交分離選擇育成的優(yōu)良高代自交系，它具有苗期耐熱性較強(qiáng)、早熟、配組蘿卜品質(zhì)好且產(chǎn)量高等特點。Wr129A2A1是‘種都2號’雜交一代圓白蘿卜品種經(jīng)多代連續(xù)自交分離選擇育成的高代自交系，對熱敏感，但抗病性強(qiáng)。因此，本研究以耐熱性較強(qiáng)的11162-3-1T-1和對熱敏感的Wr129A2A1為材料，對比研究高溫脅迫對二者幼苗生長、光合作用、細(xì)胞膜透性、滲透物質(zhì)含量和抗氧化活性的影響，以及熱激脅迫相關(guān)基因在葉片中的表達(dá)情況，為蘿卜耐熱材料創(chuàng)制及新品種選育提供科學(xué)依據(jù)，同時為蘿卜耐高溫機(jī)理機(jī)制解析提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

田間自然高溫脅迫試驗材料12份，苗期高溫脅迫試驗材料為篩選出的熱敏感材料Wr129A2A1和耐熱性較強(qiáng)的材料11162-3-1T-1，其中‘熱白50天’由重慶科光種苗有限公司提供，‘糖晶’由重慶方正農(nóng)業(yè)有限公司提供，其余10份材料均由重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供(表2)

1.2 田間表型調(diào)查

2021年6月18日，12份蘿卜材料于國家蔬菜改良中心重慶分中心試驗基地播種，1 m開廂雙行種植，每份材料種植30株，行距0.50 m，株距 0.40 m，單株栽培，設(shè)3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。田間管理同常規(guī)大田栽培管理。于播種后1個月調(diào)查植株長勢，60 d后，田間選取生長一致的10個單株，測量每個單株的最大葉長、最大葉寬、葉重、根長、根粗和根重，同時調(diào)查每份材料的越夏死亡率和抗病性。

1.3 蘿卜苗期高溫脅迫處理

隨機(jī)選取Wr129A2A1和11162-3-1T-1健康飽滿且無病蟲害的種子在55～58 ℃熱水中浸泡30 min，轉(zhuǎn)入鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中黑暗條件下發(fā)芽，溫度25～28 ℃，期間保持濾紙濕潤。將發(fā)芽種子播于裝有育苗基質(zhì)的50孔穴盤中，置于26 ℃人工氣候箱內(nèi)生長(Climacell 222，德國MMM)，光照強(qiáng)度12 000 Lx、光照12 h，空氣相對濕度60%～70%。待苗生長至三葉一心時剔除弱苗，選取均勻一致的6株幼苗種植于營養(yǎng)缽中。五葉一心時進(jìn)行高溫處理，處理條件為: 38 ℃熱激處理2 h后，26 ℃恢復(fù)生長48 h, 然后40 ℃熱處理24 h，再置于26 ℃恢復(fù)生長1周(先弱光下生長 2 d，然后在正常光照條件下生長5 d)，拍照記錄(高溫處理只取到24 h，高溫處理到48 h時蘿卜幼苗已經(jīng)死亡)。以上每個處理設(shè)3個重復(fù)。

1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

將Wr129A2A1和11162-3-1T-1種子按上述方法培養(yǎng)，五葉一心時放入40 ℃人工氣候箱中進(jìn)行高溫處理，分別于處理0、6、24 h后將所測幼苗放入黑暗中適應(yīng) 30 min，然后剪下已充分展開的功能葉用調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)IMAGING-PAM(德國WALZ)測定光合系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)，每個時間點隨機(jī)選取10株。

1.5 苗期耐熱性相關(guān)生理生化指標(biāo)測定

將Wr129A2A1和11162-3-1T-1按上述方法培養(yǎng)至五葉一心時進(jìn)行40 ℃高溫處理，在處理 0、6、24 h后隨機(jī)選取5株幼苗的地上部分，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)用于測定各項指標(biāo)，每個處理設(shè)3個重復(fù)。采用丙酮乙醇混合液法測定葉綠素含量[8]，采用蒽酮法測定可溶性糖含量、茚三酮比色法測定游離脯氨酸(Pro)含量、硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定丙二醛(MDA)含量、硫酸鈦光度法測定H2O2含量、氮藍(lán)四唑(NBT) 法測定超氧化物歧化酶(SOD) 活性、紫外吸收法測定抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性[9]，各指標(biāo)的測定均設(shè)置3個重復(fù)。

1.6 基因表達(dá)量檢測

利用Trizol試劑(Invitrogen)參照說明書提取高溫脅迫各時間點(0、6、24 h)樣品RNA,并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcription system(Promega 公司)進(jìn)行cDNA的第一鏈合成。

以 cDNA為模，RsActin為內(nèi)參[10]，采用定量試劑盒 SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa 公司)的操作步驟在實時熒光定量 PCR 儀(Applied Biosystems 7500，F(xiàn)oster City，USA)上檢測候選基因的表達(dá)量。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃、3 min；95 ℃、5 s，58 ℃、30 s，72 ℃、10s，40個循環(huán)；60 ℃收集熒光。每個實驗3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，基因相對表達(dá)量采用ΔΔCT 法計算。所有基因特異引物(表 1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 用于實時定量PCR分析的引物信息Table 1 Gene specific primers used for quantitative RT-PCR analysis

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用 Excel和 OriginPro8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗期間田間氣溫動態(tài)和材料耐熱性表現(xiàn)

大田監(jiān)控的氣溫數(shù)據(jù)(圖 1)顯示，2021年的 7 月20日至 8 月6日,以及 8月16日至8月21日之間均出現(xiàn)了不同時長和時段的田間自然高溫天氣條件(日均溫在 30 ℃以上，且最高溫在35 ℃以上持續(xù)13 d)，完全達(dá)到了蘿卜材料熱害鑒定條件。

田間觀測結(jié)果顯示，不同蘿卜材料在自然高溫條件下耐熱性表現(xiàn)出顯著差異(表2)。在12份供試蘿卜材料中，其中3份材料WC19-57，Wr129A2A1和‘糖晶’在越夏栽培期間全部死亡；‘熱白50天’、W20-15和W20-13前期植株長勢和成熟期肉質(zhì)根商品率表現(xiàn)較耐熱，但抗性較差，越夏死株率超過20%；11162-3-1T-1和‘秋雪’在整個生長期間，植株長勢正常，葉色翠綠，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱性。因此，選取其中熱敏感的Wr129A2A1和耐熱性較強(qiáng)的11162-3-1T-1進(jìn)行后續(xù)苗期高溫脅迫試驗研究。

表2 不同類型蘿卜材料田間自然高溫脅迫下性狀表現(xiàn)與耐熱性分析Table 2 Analysis on field traits and heat resistance of different radish varieties

2.2 苗期高溫對蘿卜幼苗生長狀況的影響

在40 ℃高溫處理24 h并在室溫恢復(fù)生長7 d后，Wr129A2A1和11162-3-1T-1苗期耐熱性強(qiáng)弱的表現(xiàn)差異顯著。其中，耐熱材料11162-3-1T-1在高溫條件下仍然保持綠色(圖2)，在室溫條件下恢復(fù)生長1周后全部成活；熱敏感材料Wr129A2A1高溫處理24 h后， 幼苗脫水嚴(yán)重，植株萎蔫、干枯變黃、甚至整株枯死，室溫下無法恢復(fù)。

2.3 高溫脅迫對蘿卜幼苗葉片最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)值和葉綠素含量的影響

高溫處理后，雖然Wr129A2A1和11162-3-1T-1葉片的總?cè)~綠素含量和Fv/Fm值隨著脅迫時間的增加都呈下降趨勢，但是11162-3-1T-1葉片中Fv/Fm值和葉綠素含量都明顯高于同期的Wr129A2A1(圖 3)。其中，在高溫脅迫處理6 h后，Wr129A2A1和11162-3-1T-1葉片中Fv/Fm分別下降至0.261和0.547；脅迫24 h后，Wr129A2A1葉片的Fv/Fm幾乎為零，而 11162-3-1T-1仍為 0.457(圖3，A)，同時11162-3-1T-1葉片中總?cè)~綠素含量約是Wr129A2A1的2倍(圖3，B)。這些結(jié)果表明耐熱材料11162-3-1T-1在高溫脅迫下仍能維持較高的光合能力，表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐熱性。

2.4 高溫脅迫對蘿卜幼苗葉片可溶性糖和脯氨酸含量的影響

在高溫脅迫處理后，Wr129A2A1和11162-3-1T-1葉片中的可溶性糖和脯氨酸含量都呈上升趨勢(圖4)。其中，11162-3-1T-1葉片的可溶性糖含量在高溫脅迫處理6 h后約是Wr129A2A1的1.61倍，在脅迫24 h后約是Wr129A2A1的3.18倍，差異達(dá)到極顯著水平(圖4，A)；與適溫處理(0 h)相比，11162-3-1T-1和Wr129A2A1葉片中脯氨酸含量在高溫處理24 h后分別增加了46.91%和43.73%，但是兩個材料間的脯氨酸含量在高溫處理下始終未見明顯差異(圖4，B)。

2.5 高溫脅迫對蘿卜幼苗葉片MDA和H2O2含量的影響

高溫脅迫處理后，雖然Wr129A2A1和11162-3-1T-1葉片MDA和H2O2含量都呈上升趨勢，但是11162-3-1T-1增幅相對較小(圖5)。其中，高溫脅迫處理24 h后，Wr129A2A1葉片MDA含量是11162-3-1T-1的1.29倍，差異達(dá)到顯著水平(圖5，A)。11162-3-1T-1葉片H2O2含量在脅迫處理6 h后迅速增加，是Wr129A2A1的1.58倍，兩者無顯著差異；隨后，兩者葉片H2O2含量均繼續(xù)增加，Wr129A2A1的上升幅度更大，在脅迫處理24 h后是11162-3-1T-1的1.56倍，差異達(dá)到極顯著水平 (圖5，B)。

2.6 高溫脅迫對蘿卜葉片抗氧化酶SOD和APX活性的影響

在40 ℃ 高溫處理24 h后，11162-3-1T-1 葉片SOD活性迅速從146.74 U/g上升至2 141.18 U/g，大幅度增加了13.59倍，是同期Wr129A2A1的2.51倍，差異達(dá)到顯著水平(圖6，A)。同時，Wr129A2A1葉片APX活性在高溫處理后未見明顯變化，而11162-3-1T-1葉片中的APX活性在高溫處理6 h后是同期Wr129A2A1的1.64倍，差異達(dá)到極顯著水平(圖6，B)。

2.7 高溫脅迫對蘿卜脅迫相關(guān)基因表達(dá)的影響

研究表明，HsfA2作為植物細(xì)胞熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵組分，它的表達(dá)水平與熱激脅迫誘導(dǎo)的AtHSP101、AtHsa32、sHSP-CI、APX2和SUS的表達(dá)水平密切相關(guān)[11]。為了確定蘿卜HsfA2基因在熱脅迫下的潛在作用，利用qRT-PCR技術(shù)分析了兩個不同耐熱性材料中RsHsfA2、RsHSP101、RsHsa32、RsHSP25.3、RsHSP18.2-CI、RsAPX2、RsSUS1和RsGolS1在高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平(圖7)。其中，兩個材料的RsHsfA2、RsHsa32、RsHSP18.2-CI和RsGolS1基因在高溫脅迫下持續(xù)上調(diào)表達(dá)，與Wr129A2A1相比，11162-3-1T-1的RsHsfA2和RsGolS1在處理24 h后顯著上調(diào)，RsHSP101、RsAPX2、RsSUS1和RsHSP25.3在處理6 h后迅速上調(diào)達(dá)到最大值，表明高溫脅迫能夠誘導(dǎo)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高11162-3-1T-1對高溫脅迫的耐受能力。

3 討 論

高溫不僅可造成作物損傷或死亡，還會引起一系列生理及代謝物的變化。光合作用是植物對溫度變化最為敏感的代謝反應(yīng)，植物在高溫脅迫下會減少葉綠素的合成以及葉綠體的形成[12]。研究表明，耐熱型水稻可以在高溫條件下通過維持較高的葉綠素含量從而提高對高溫的耐受能力[13]，過表達(dá)BrHSF16的轉(zhuǎn)基因擬南芥Fv/Fm顯著增加，并在高溫條件下表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢[14]。在本研究高溫脅迫條件下，耐熱蘿卜材料11162-3-1T-1的葉綠素含量和Fv/Fm明顯高于熱敏感材料Wr129A2A1，表明11162-3-1T-1可通過維持較高的葉綠素含量和Fv/Fm來調(diào)節(jié)光合作用，以此緩解高溫帶來的傷害。

同時，在高溫脅迫下，獼猴桃、蝴蝶蘭、生菜、棉花和擬南芥葉片可通過積累可溶性糖和脯氨酸來提高對高溫脅迫的耐受能力[12]。在高溫處理24 h后，本研究中耐熱材料11162-3-1T-1葉片中可溶性糖含量是熱敏感Wr129A2A1的3.18倍；雖然11162-3-1T-1葉片中脯氨酸含量隨著高溫處理時間的增加而增加，但與Wr129A2A1相比未見明顯差異，表明11162-3-1T-1在高溫脅迫下可通過提高可溶性糖含量來增強(qiáng)自身滲透調(diào)節(jié)能力。

另外，活性氧(ROS)水平、MDA含量、抗氧化酶活性以及抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄水平常被用作細(xì)胞膜和細(xì)胞膜氧化損傷的判別指標(biāo)，從而反映植物對高溫脅迫的耐受能力[15]。例如，高溫脅迫下耐熱水稻品種NERICA-L-44和Nagina 22通過增加抗氧化酶活性，減少ROS和MDA含量來提高耐熱脅迫能力[13,16]；高溫脅迫不但可以提高小麥、高羊茅和番茄SOD、APX、CAT、POX和GR活性[17]，還可以通過在擬南芥和水稻胞質(zhì)中大量表達(dá)抗壞血酸過氧化物酶基因APX2[18-19]，從而增強(qiáng)植物對H2O2等活性氧的清除能力。與熱敏感材料Wr129A2A1相比，本研究中高溫脅迫下耐熱性蘿卜材料11162-3-1T-1葉片的 MDA和H2O2含量下降，SOD和APX活性以及RsAPX2基因的表達(dá)量增加，表明高溫脅迫產(chǎn)生的H2O2在SOD和APX協(xié)調(diào)作用下維持在較低水平, 從而減少細(xì)胞膜的損傷, 提高了11162-3-1T-1對高溫脅迫的耐受能力。

此外，HSF作為熱脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要組成部分, 能夠誘導(dǎo)多種熱脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，在植物應(yīng)對高溫脅迫、生長和發(fā)育方面發(fā)揮重要作用[20]。例如，擬南芥AtHsfA2 缺失突變體對高溫、強(qiáng)光、缺氧和氧化脅迫敏感，而過表達(dá)AtHsfA2能提高轉(zhuǎn)基因植株對高溫、高鹽、氧化以及滲透脅迫的耐受能力[11,21]。AtHsfA2還可通過調(diào)控HSP、APX2、SUS以及GolS1等基因的表達(dá)來提高植物的耐熱性[11,22-23]。與Wr129A2A1相比，耐熱材料11162-3-1T-1脅迫相關(guān)基因在高溫處理過程中發(fā)生顯著變化，RsHSP101、RsHSP25.3、RsAPX2和RsSUS1基因在高溫處理6 h后顯著上調(diào)，RsHsfA2和RsGolS1在整個處理期間上調(diào)表達(dá)，表明高溫誘導(dǎo)多種熱脅迫響應(yīng)基因通過不同的表達(dá)模式來提高11162-3-1T-1對高溫脅迫的耐受能力。

綜上所述，耐熱蘿卜材料11162-3-1T-1可通過調(diào)控光合作用、提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、增加抗氧化酶活性以及激活熱激脅迫相關(guān)基因表達(dá)，從而增強(qiáng)幼苗對高溫脅迫的耐受能力。