姜黃素對犬骨髓間充質(zhì)干細胞遷移能力的影響

李韋瑤，鄧嘉強，趙芳芳，朱雪瑞，曹隨忠，沈留紅，余樹民

（四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 611130）

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是哺乳動物骨髓基質(zhì)中的一種能自我更新的干細胞，具有多向分化潛能和免疫調(diào)控能力[1]，在治療退行性疾病和組織創(chuàng)傷中具有廣闊的應用潛力[2]。當機體受到損傷時，MSCs通過遷移/生成生長因子、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶和表面黏附分子向靶器官靶組織介導損傷修復和再生。MSCs應用于臨床需要經(jīng)過體外擴增達到一定數(shù)量，然而MSCs在體外擴增一段時間后不可避免呈現(xiàn)老化，增殖活力和遷移能力下降，嚴重阻礙MSCs在臨床治療中的應用[3]，因此采取一系列措施如天然活性成分，遲滯MSCs老化，增強細胞活力和遷移歸巢能力，成為MSCs臨床應用研究的焦點。

姜黃素（curcumin,Cur）是從姜科及天南星科等植物根莖中提取的一種脂溶性天然活性物質(zhì)，已有研究顯示姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和抗纖維化等生物活性，并應用于傷口愈合[4]，以及在消化系統(tǒng)[5]、心血管系統(tǒng)[6]和皮膚[7]等系統(tǒng)疾病的預防和治療中也表現(xiàn)出巨大的潛力。研究發(fā)現(xiàn)在抗肺癌治療中，姜黃素通過上調(diào)miR-206表達抑制癌細胞入侵和遷移[8]。近年來，發(fā)現(xiàn)Cur處理可通過降低氧化應激，重塑細胞骨架，提高人臍帶血、人脂肪來源MSC的細胞活力[9-10]。本試驗旨在以犬骨髓來源MSCs(cBMSCs)為材料，研究Cur處理對cBMSCs遷移能力的影響，進而為cBMSCs應用于臨床治療犬相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

健康中華田園犬（6～12月齡），體質(zhì)量(10±1)kg，由四川省雅安市流浪狗救助中心提供。

1.2 試劑

LG-DMEM干粉（GIBICO公司）；胎牛血清FBS（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；青霉素、鏈霉素、胰島素、茜素紅、油紅O染液、1%結(jié)晶紫染色液、二甲基亞砜DMSO（Solarbio公司）；β-甘油磷酸鈉、吲哚美辛（MCE公司）；維生素C、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤IBMX、地塞米松（Sigma公司）；TRAPeze?Kit RT Telomerase Detection Kit與引物（上海生工生物工程股份有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa公司）；胰蛋白酶（Biofroxx公司）姜黃素（HPLC≥98%，Solarbio公司）；DAPI染液、微絲綠色熒光探針（Actin-Tracker Green-488，碧云天生物技術(shù)有限公司）；24孔板Transwell-膜嵌套（Corning公司）；細胞凋亡與壞死檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 犬骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

取6～12月齡犬全身麻醉后，采用肱骨股骨頭穿刺收集骨髓液[11]。加等量的PBS與肝素鈉配制的抗凝液混勻，1 500 r/min離心5 min，重復洗滌2次。將細胞沉淀直接用完全培養(yǎng)液進行懸浮，經(jīng)血球計數(shù)板計數(shù)，按1×108～109cells/mL的密度接種，置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3 d后半量換液，此后每3～4 d換液一次。待原代細胞培養(yǎng)在多個視野內(nèi)細胞達至80%～90%融合，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入適量用胰酶消化液于37℃下消化2～3 min，在顯微鏡下觀察到細胞變圓漂浮，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化，輕柔吹打使細胞充分脫落，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，1 200 r/min離心8 min，重懸后按1∶3比例傳代，3 d換液1次，隔1 d觀察細胞生長狀態(tài)，每5～7 d傳代1次。

接種細胞（P3）至6孔培養(yǎng)板（3×104cells/mL），待細胞長至90%～100%融合時，分別更換成骨和成脂分化誘導液進行分化誘導，3 d換液1次。成脂誘導14 d后，采用油紅O染色觀橘紅色脂肪顆粒；成骨誘導21 d后，采用茜素紅染色觀察鈣化結(jié)節(jié)。

1.4 細胞分組與姜黃素處理

取同批次的第3代（P3）cBMSCs和第6代（P6）cBMSCs進行接種培養(yǎng)，待細胞貼壁后對P6-cBM?SCs添加Cur（0、0.1、1和10 μmol/L）預處理24 h，分別設(shè)置 P3-cBMSCs為P3組和P6-cBMSCs+Cur（0、0.1、1和10 μmol/L）為姜黃素處理組。

1.4.1 細胞劃痕實驗

按2×105cells/孔接種細胞，每孔設(shè)置3個重復，待細胞鋪滿板底后用10 μL槍頭對同一批次來源P3-cBMSCs和P6-cBMSCs垂直劃痕，采集初始劃痕照片。按1.4處理細胞，細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察和評估劃痕愈合情況后取樣拍照，每孔按上下左右4個方向分別采集4個視野，應用Image Pro Plus 6.0（IPP）對細胞遷移面積進行定量分析，計算細胞劃痕愈合率。劃痕愈合率=[（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積]×100%。

1.4.2 Transwell細胞遷移實驗

取孔徑為8 μm的24孔Transwell板，分別將上室與下室加入少許基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱溫育1 h，以充分浸潤聚碳酸酯膜。按1.4處理cBMSCs后經(jīng)胰酶消化后離心收集，PBS洗滌2次，用無血清的DMEM以1×105cells/mL懸浮細胞，取溫育后的Transwell板，棄去培養(yǎng)液，上室加入200 μL細胞懸液，下室加入800 μL含10%FBS的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復孔。置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，用DAPI法對小室外表面進行染色，于熒光顯微鏡下觀察拍照（每孔隨機4個視野），并通過Im?age J統(tǒng)計計數(shù)。

1.4.3 微絲綠色熒光探針（Actin-Tracker Green-488）觀察細胞質(zhì)骨架

細胞按1×104cells/孔的密度接種至12孔板，每組設(shè)置3個復孔，按1.4處理cBMSCs，PBS洗滌細胞2次后用4%多聚甲醛固定液固定15 min，再用含0.1%Triton X-100的PBS洗滌細胞3次，每次3～5 min，加入現(xiàn)配的染色工作液（250 μL/孔），室溫避光孵育45 min，0.1%的Triton X-100的PBS洗滌2次，每次3～5 min，再加入DAPI染色液染色15 min，經(jīng)PBS洗滌，于熒光顯微鏡下觀察到細胞被綠色熒光探針標記染色后拍照記錄。

1.4.4 RT-qPCR檢測細胞遷移相關(guān)基因表達

基于上述試驗，采用Trizol法提取細胞總RNA，將已獲取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物（引物序列及參數(shù)見表1），進行熒光定量PCR反應。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 The primer sequences used for RT-qPCR

1.4.5 細胞壞死與凋亡檢測

分別收集姜黃素處理組細胞約1×105cells于1.5 mL離心管內(nèi)，離心棄上清。細胞沉淀用細胞染色緩沖液重懸。分別加入5 μL Hoechst染色液和PI染色液，混勻，4℃孵育20～30 min。用PBS洗滌1次，在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光和藍色熒光，拍照記錄。

1.4.6 細胞相對端粒長度檢測

提取姜黃素處理組細胞基因組DNA，核酸蛋白分析儀測定所提取DNA的純度和濃度，將DNA梯度稀釋，制作標準曲線。通過RT-qPCR獲取端粒（Tel）和36B4的Ct值。以log（ng DNA）為橫坐標，Ct值為縱坐標，分別制作端粒和36B4的標準曲線。將待測樣品DNA以相同反應體系和反應條件進行RTq-PCR反應。將所測樣品端粒的Ct值代入到端粒標準曲線方程中，得出相應Ct值對應的ng DNA值，即T值。將所測樣品36B4基因的Ct值代入到36B4標準曲線方程中，得出相應Ct值對應的ngDNA值，即S值。同一個樣品的T值與S值的比值（T/S）即為該樣品的相對端粒長度，36B4和Tel引物序列見表1[12]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA）和配對t檢驗，數(shù)據(jù)表示為均值±標準差（±s），插圖通過GraphPad Prism 7.0軟件進行排版和整理，P<0.05表示差異顯著（用“*”表示），P<0.01表示差異極顯著（用“**”表示）。

2 結(jié)果與分析

2.1 犬骨髓間充質(zhì)干細胞的傳代培養(yǎng)與鑒定

將cBSMCs體外培養(yǎng)，細胞傳至第3代在倒置顯微鏡下呈梭形、紡錘狀，輪廓清晰，折光性強，具有良好的增殖特性；相比于第3代，細胞傳至第6代時部分出現(xiàn)衰老變形、細胞輪廓不清晰，胞漿逐漸出現(xiàn)細微顆粒，增殖速度減慢的現(xiàn)象；傳至第9代，幾乎所有細胞均呈現(xiàn)老化特征，且細胞處于生長停滯狀態(tài)（圖1）。

圖1 體外傳代細胞形態(tài)學特征Figure 1 The morphology of BMSCs in vitro expansion(scale bar=100 μm).

對cBMSCs分別進行成脂和成骨分化誘導，14 d后采用油紅O染色后觀察到細胞內(nèi)的橘紅色的脂肪顆粒(圖2A)，成骨誘導21 d后茜素紅染色觀察到紅色鈣化結(jié)節(jié)（圖2B），表明cBMSCs能夠向脂肪細胞和成骨細胞分化，具有MSCs的特性。

圖2 cBMSCs成脂和成骨分化特性Figure 2 Adipogenic and osteogenic differentiation characteristics of cBMSCs.(scale bar=100 μm)

2.2 姜黃素對犬骨髓間充質(zhì)干細胞遷移、侵襲的影響

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示（圖3A），相比P3組，P6-cBMSCs的劃痕愈合率顯著下降[（49.48±13.00）%vs（69.54±6.33）%，P<0.01]，cBMSCs遷移能力在傳代過程中受損。姜黃素處理后，P6-cBMSCs的愈合率顯著提高[(65.85±11.16)%vs(49.5±13.0)%，P<0.01；(71.44±8.66)%vs(49.5±13.0)% ，P<0.01;(60.92±10.87)%vs(49.5±13.0)%，P<0.05]，其中添加1 μmol/L濃度的Cur細胞愈合效果最佳。

圖3 姜黃素對犬骨髓間充質(zhì)干細胞遷移、侵襲的影響Figure 3 Effects of curcumin on migration and invasion of cBMSCs.(scale bar=100 μm)

Transwell細胞遷移實驗結(jié)果顯示（圖3B），相比于P3組，P6-cBMSCs穿透至下層的數(shù)量cBMSCs明顯減少（61.75±8.67 vs 115.58±14.11，P<0.01）。姜黃素處理后，P6-cBMSCs遷移數(shù)量均極顯著增多（88.75±10.18 vs 61.75±8.67；106.42±6.99 vs 61.75±8.67；78.58±6.75 vs 61.75±8.67，P<0.01），其 中1 μmol/L濃度的Cur作用效果為最佳。

細胞形態(tài)維持、內(nèi)部結(jié)構(gòu)合理以及遷移運動都與細胞質(zhì)骨架密切相關(guān)。微絲綠色熒光探針染色結(jié)果顯示，P3組cBMSCs充分貼壁鋪展，可以觀察到形態(tài)挺直的應力纖維和絲狀偽足結(jié)構(gòu)，P6-cBMSCs圓合度較高，應力纖維彎曲且稀少，姜黃素處理后cBMSCs可見應力纖維增多（圖3C）。

RT-qPCR檢測3種與cBMSCs遷移相關(guān)的因子（MMP-2、MMP-9和CXCL8）的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，相比P3組，P6-cBMSCs的MMP-2和MMP-9基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著下調(diào)（P<0.01），而CXCL8的表達沒有顯著差異。經(jīng)姜黃素處理后，MMP-2和CXCL8的表達均極顯著上調(diào)（P<0.01），MMP-9的表達上調(diào)，但差異不顯著（圖3D）。綜上，Cur的處理能顯著提高cBMSCs的遷移能力。

2.3 姜黃素對犬骨髓間充質(zhì)干細胞壞死與凋亡和相對端粒長度的影響

細胞壞死與凋亡檢測結(jié)果顯示，P6-cBMSCs經(jīng)姜黃素處理后凋亡和壞死細胞比例有所下降，表明Cur一定程度上維持cBMSCs的細胞活力，延緩凋亡和壞死(圖4A)。細胞相對端粒長度檢測結(jié)果顯示，姜黃素能延緩相對端粒長度的縮短，其中1 μmol/L濃度的Cur作用顯著（P<0.05）(圖4B)。綜上，Cur處理能抑制cBMSCs凋亡，遲滯相對端粒長度縮短。

圖4 姜黃素對犬骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡和相對端粒長度的影響Figure 4 Effects of curcumin on necrosis,apoptosis and relative telomere length of cBMSCs

3 討論與結(jié)論

本試驗采集犬骨髓通過細胞貼壁法分離cBM?SCs，根據(jù)細胞形態(tài)和分化試驗，顯示所分離細胞具有文獻報道的cBMSCs特點[11]。大量研究發(fā)現(xiàn)MSCs隨著傳代次數(shù)的增加而衰老，表現(xiàn)細胞活力、遷移能力和分化潛能下降，更傾向于分化為脂肪細胞，成骨分化潛能減弱，免疫調(diào)節(jié)功能異常[13]，而老化MSCs移植后絕大多數(shù)在24 h即死亡[14]。同樣，本試驗所分離cBMSCs培養(yǎng)至P6代就呈現(xiàn)體積增大，扁平輪廓不清，細胞活力降低等老化表型，其遷移能力相應減弱。

細胞的遷移能力是MSCs活力和歸巢能力的重要體現(xiàn)，為MSCs介導組織修復再生所必需，目前在移植前多采用低氧和一些活性物質(zhì)等進行預處理提高MSCs活力和遷移能力，進而提高臨床治療的效力[15]。最近的研究顯示，1 μg/mL Cur處理使人臍帶血來源MSCs（HUMSCs）遷移能力顯著增強，尤其納米負載的Cur其生物學作用大大增強，并證實其促遷移作用與細胞骨架重塑密切相關(guān)[9]；同樣，H.Ghufran[10]等在研究用姜黃素預處理人脂肪干細胞（hASCs）在抗高血糖應激的作用中發(fā)現(xiàn)，Cur（5 μmol/L）預處理24 h可以改善hASCs的遷移能力。本試驗以呈現(xiàn)衰老表型的P6代cBMSCs為材料，細胞劃痕實驗、Transwell實驗均顯示1 μmol/L姜黃素處理顯著增強cBMSCs遷移能力，即劃痕愈合率顯著上升，而遷移至Transwell小室外表面的細胞數(shù)量顯著增加，細胞應力纖維數(shù)量和排列得到改善。已有研究證實，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2、MMP-9）和趨化因子CXCL-8參與細胞遷移過程[16-17]，王俊等[18]發(fā)現(xiàn)川芎嗪上調(diào)MSCs的MMP-2、MMP-9表達,促進BMSCs遷移。本研究同樣顯示，Cur能上調(diào)遷移相關(guān)因子（MMP-2、MMP-9和CXCL8）的基因表達水平，促進cBMSCs的遷移。

MSCs作為有絲分裂細胞，端粒長度隨著細胞擴增培養(yǎng)逐漸縮短，逐漸失去細胞活力，最終進入到不可逆轉(zhuǎn)的衰老狀態(tài)[19]。Deng J.等[20]發(fā)現(xiàn)Cur（1 μmol/L）能夠有效維持細胞活力，改善體外復制性衰老cBMSCs的衰老表型和遷移能力損傷。本研究中，我們通過凋亡與壞死試劑盒以及相對端粒長短檢測來進一步評估Cur對cBMSCs活力的影響。結(jié)果顯示，Cur可以降低細胞凋亡和壞死程度，延緩端粒長度縮短，進而保持細胞活力和延緩細胞衰老，這可能是改善MSCs遷移能力的重要基礎(chǔ)。

綜上，1 μmol/L濃度Cur可以增加cBMSCs細胞微絲生成，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2、MMP-9）和趨化因子CXCL8的表達，延緩端粒長度縮短，改善衰老cBMSCs的遷移能力。